多聚酶链式反应扩增DNA片段ppt课件

1、课题课题2 2多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增dnadna片段片段课程标准课程标准尝尝试试pcrpcr技术的基本操作和应用。技术的基本操作和应用。课标解读课标解读1.1.理理解解pcrpcr技术的基本原理。技术的基本原理。2.2.知道知道pcrpcr技术的基本操作过程。技术的基本操作过程。3.3.讨论讨论pcrpcr技术的应用。技术的应用。 1 1生物体内生物体内dnadna分子复制的条件分子复制的条件(1)(1)四四种种 是合成子链的原料。是合成子链的原料。(2) (2) 提供了提供了dnadna复制的模板。复制的模板。(3) (3) 打开了打开了dnadna双链。双链。(4) (4)

2、催化合成催化合成dnadna子链。子链。( 5 ) ( 5 ) 使使 d n ad n a 聚 合 酶 能 够 从聚 合 酶 能 够 从 开始连接脱氧核苷酸。开始连接脱氧核苷酸。pcr技术的原理及反应过程技术的原理及反应过程 脱氧核苷酸脱氧核苷酸dna母链母链解旋酶解旋酶dna聚合酶聚合酶引物引物引物的引物的3端端2 2pcrpcr扩增的原理及条件扩增的原理及条件(1)(1)概概念念pcrpcr即即 ，是一种，是一种 迅速迅速 的技术。它能以极少量的的技术。它能以极少量的 为模板，在短时间内复制出上百万份为模板，在短时间内复制出上百万份的的 。(2)(2)原理原理dnadna的热变性：在的热变

3、性：在 的温度范围内，的温度范围内，dnadna双螺旋结构解体，双链分开，这个过程称为双螺旋结构解体，双链分开，这个过程称为 。当温度缓慢。当温度缓慢 后，两条彼此分离的后，两条彼此分离的dnadna链又会重新链又会重新 。子链的合成：子链的合成：a.a.需要需要 ；b.b.合成方向总是从子链的合成方向总是从子链的 端向端向 端延伸。端延伸。多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外扩增扩增dna片段片段dnadna拷贝拷贝80100变性变性降低降低结合成双链结合成双链引物引物53(3)(3)条件条件 模板。模板。分别与模板分别与模板dnadna两条模板链相结合的两种两条模板链相结合的两种 。a a

4、、t t、g g、c c四种四种 。耐热耐热dnadna聚合酶，一般聚合酶，一般用用 。需要一定的需要一定的 和能严格控制和能严格控制 的温控设的温控设备。备。dna引物引物脱氧核苷酸脱氧核苷酸耐高温的耐高温的taqdna聚合酶聚合酶缓冲溶液缓冲溶液温度温度3 3pcrpcr反应过程反应过程pcrpcr一一般要经历般要经历 次循环，每次循环可以分次循环，每次循环可以分为为 、 和和 三步。三步。(1) (1) ：当温度上升到：当温度上升到 以上时，双链以上时，双链dnadna解聚为单解聚为单链。链。(2) (2) ：温度下降到：温度下降到 左右，左右， 通过通过 与两条单链与两条单链dnadn

5、a结合。结合。(3) (3) ：温度上升到：温度上升到 左右，溶液中的四种脱氧核左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在苷酸在 的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的dnadna链。链。三十多三十多变性变性复性复性延伸延伸变性变性90复性复性50两种引物两种引物碱基互补配对碱基互补配对延伸延伸72dna聚合酶聚合酶 思维激活思维激活11 dn dna a复复制缘何必须有引物？制缘何必须有引物？提示提示dnadna聚合酶不能从头合成聚合酶不能从头合成dnadna，而只能以，而只能以33延伸延伸dnadna链，故链，故dnadna合成合成时，必须加入引物时，必须加入引物

6、( (其其33游离游离) )以作为延长以作为延长dnadna子链的子链的“引子引子”。1 1细胞内细胞内dnadna复制和细胞外复制和细胞外pcrpcr扩增的比较扩增的比较( (见下表见下表) )项目项目dna复制复制pcr扩增扩增不不同同点点场所场所细胞内细胞内细胞外细胞外能量能量atp提供能量提供能量不需不需atp提供能量提供能量酶酶解旋酶、解旋酶、dna聚聚合酶合酶耐热的耐热的taqdna聚聚合酶合酶是否有是否有转录转录伴有转录、产生伴有转录、产生引物引物无转录、需加入两无转录、需加入两种引物种引物特点特点边解旋边复制，边解旋边复制，半保留复制半保留复制体外迅速扩增体外迅速扩增循环次循环

7、次数数受生物体自身控受生物体自身控制制30多次多次相相同同点点原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸复制原复制原理理严格遵循碱基互补配对严格遵循碱基互补配对原则原则模板模板dna为模板为模板引物引物都需要与模板相结合的都需要与模板相结合的引物引物 2.pcr2.pcr过程过程(1)(1)变变性性当温度上升到当温度上升到90 90 以上时，双链以上时，双链dnadna解聚为单链。解聚为单链。(2)(2)复性复性温度下降到温度下降到50 50 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链dnadna结结合。合。(3)(3)延伸延伸温度上升到温度上升到72 72 左

8、右，溶液中的四种脱氧核苷酸左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(a(a、t t、c c、g)g)在在dnadna聚合聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的dnadna链。链。特别提醒特别提醒(1)72 (1)72 左右时，左右时，taqtaqdnadna聚合酶有最大活性，可使聚合酶有最大活性，可使dnadna新链由新链由55端向端向33端延伸。端延伸。(2)dna(2)dna聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的dnadna序列，使该段固序列，使该段固定长度的序列呈定长度的序列呈“指数式指数式”扩增。扩增。【巩固巩

9、固1 1】 标标准的准的pcrpcr过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是步需要的温度依次是( () )。a a94 94 、55 55 、72 72 b b72 72 、55 55 、94 94 c c55 55 、94 94 、72 72 d d80 80 、55 55 、72 72 解析解析当温度上升到当温度上升到90 (9090 (9096 )96 )以上时，双链以上时，双链dnadna解聚为单链，解聚为单链，称之为变性；当温度下降到称之为变性；当温度下降到50 (4050 (4060 )60 )左右时，两种引物通过左右时

10、，两种引物通过碱基互补配对与两条单链碱基互补配对与两条单链dnadna结合；当温度上升到结合；当温度上升到72 (7072 (7075 )75 )时，时，溶液中的四种脱氧核苷酸在溶液中的四种脱氧核苷酸在taqtaq dna dna聚合酶的作用下，根据碱基互补配聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的对原则合成新的dnadna链，称为延伸。链，称为延伸。答案答案a a1 1实验用具实验用具(1)pcr(1)pcr仪仪：该仪器能自动调控：该仪器能自动调控 ，实现，实现dnadna的扩增。如果没有的扩增。如果没有pcrpcr仪，可用仪，可用3 3个个 代替，操作时按程序在代替，操作时按程序在3

11、3个个 中中 pcrpcr反应的微量离心管。反应的微量离心管。(2)(2)微量离心管：总容积为微量离心管：总容积为 ，实际上是进行，实际上是进行 的场所。的场所。(3)(3)微量移液器：用微量移液器：用于于 。pcr技术的实验操作及评价技术的实验操作及评价 温度温度恒温水浴锅恒温水浴锅水浴锅水浴锅来回转移来回转移0.5ml多聚酶链式反应多聚酶链式反应转移转移pcr配方中的液体配方中的液体2 2操作步骤操作步骤准准备备 混合混合 反应。反应。3 3操作提示操作提示(1)(1)为为避免避免 等因素的污染，实验中使用的一些用等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行具在使用前必须进行 。(2

12、)(2)所用的所用的 和和 应分装成小份，并在应分装成小份，并在 储存。储存。(3)(3)在在 中添加反应成分时，每吸取一种中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须试剂后，移液器上的枪头必须 。加入组分加入组分设置设置pcr的循环程序的循环程序外源外源dna高压灭菌高压灭菌缓冲液缓冲液酶酶20微量离心管微量离心管更换更换 思维激活思维激活22 pcr pcr操操作中模板作中模板dnadna是否需解旋？需要旋转酶吗？是否需解旋？需要旋转酶吗？提示提示pcrpcr操作中，模板操作中，模板dnadna仍需解旋，但该解旋过程不是仍需解旋，但该解旋过程不是dnadna解旋酶催化解旋酶催化的

13、结果，而是利用的结果，而是利用dnadna热变性的原理，在热变性的原理，在8080100 100 温度范围内，温度范围内，dnadna双螺双螺旋结构将解体，双链分开，以此达到解旋的目的。旋结构将解体，双链分开，以此达到解旋的目的。1 1pcrpcr仪：仪：pcrpcr自动化程度较高，参照下表设计程序即可。自动化程度较高，参照下表设计程序即可。循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸第第1次次94 ，10 min30次次94 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min最后一最后一次次94 ，1 min55 ，30 s72 ，1 min ( (将微量离心管放在离心机上，离心约将微量离心管放在离心机上

14、，离心约10 s。目的是使反。目的是使反应液集中在离心管底部应液集中在离心管底部) ) 3 3实验中实验中dnadna含量的测定含量的测定dnadna在在260 nm260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与dnadna的含的含量有关。可以利用量有关。可以利用dnadna这一特点进行这一特点进行dnadna含量的测定，具体方法如下：含量的测定，具体方法如下：稀释：稀释：2lpcr2lpcr反应液，加入反应液，加入98l98l蒸馏水，即将样品进行蒸馏水，即将样品进行5050倍稀释倍稀释对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长对照调零：以蒸馏水作

15、为空白对照，在波长260 nm260 nm处，将紫外分光处，将紫外分光光度计的读数调节至零光度计的读数调节至零测定：取测定：取dnadna稀释液稀释液100l100l至比色杯中，测定至比色杯中，测定260 nm260 nm处的光吸收值处的光吸收值计算：计算：dnadna含量含量(g)(g)5050(260 nm(260 nm的读数的读数) )稀释倍数稀释倍数特别提醒特别提醒若没有若没有pcrpcr仪，可进行水浴扩增仪，可进行水浴扩增dnadna设置设置3 3个恒温水浴锅，温度分别为个恒温水浴锅，温度分别为94 94 、55 55 和和72 72 ，在，在3 3个水浴锅中个水浴锅中依据依据pcr

16、pcr仪的处理时间来回转移仪的处理时间来回转移pcrpcr反应的微量离心管即可。反应的微量离心管即可。【巩固巩固2 2】 聚聚合酶链式反应合酶链式反应(pcr(pcr技术技术) )是体外酶促合成特异是体外酶促合成特异dnadna片段的一片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的循环进行，使目的dnadna得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于pcrpcr技术叙述不正确的是技术叙述不正确的是( () )。a apcrpcr技术是在实验室中以少量技

17、术是在实验室中以少量dnadna制备大量制备大量dnadna的技术的技术b b反应中新合成的反应中新合成的dnadna又可以作为下一轮反应的模板又可以作为下一轮反应的模板c cpcrpcr技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增d d应用应用pcrpcr技术与探针杂交技术可以检测基因突变技术与探针杂交技术可以检测基因突变解析解析pcrpcr技术是人工合成技术是人工合成dnadna的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。酸。答案答案c c【例例1 1】 (2011(2011江苏江苏) )请请回答有关问题。回答有关问题

18、。(1)(1)利用利用pcrpcr技术扩增目的基因，其原理与细胞内技术扩增目的基因，其原理与细胞内dnadna复制类似复制类似( (如下图如下图所示所示) )。图中引物为单链。图中引物为单链dnadna片段，它是子链合成延伸的基础。片段，它是子链合成延伸的基础。pcr技术的原理技术的原理 从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物a a的的dnadna片段所占的比例为片段所占的比例为_。在第在第_轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的dnadna片段。片段。(2)(2)设计引物是设计引物是pcrpcr技术关键步骤之

19、一。某同学设计的两组引物技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物( (只标注了只标注了部分碱基序列部分碱基序列) )都不合理都不合理( (如下图如下图) )，请分别说明理由。，请分别说明理由。第第1 1组：组：_；第；第2 2组：组：_。(3)pcr(3)pcr反应体系中含有热稳定反应体系中含有热稳定dnadna聚合酶，下面的表达式不能正确反映聚合酶，下面的表达式不能正确反映dnadna聚合酶的功能，这是因为聚合酶的功能，这是因为_。思维导图：思维导图： 归纳提升归纳提升 pcrpcr技术特点：技术特点：(1)pcr(1)pcr不需要解旋酶，而生物体内不需要解旋酶，而生物体内dnadna复制时需

20、要解旋酶；复制时需要解旋酶；(2)pcr(2)pcr需要耐热的需要耐热的dnadna聚合酶，而生物体内聚合酶，而生物体内dnadna聚合酶在高温时会变性；聚合酶在高温时会变性；(3)pcr(3)pcr一般需经三十多次循环，而生物体内一般需经三十多次循环，而生物体内dnadna复制需要生物体自身的控复制需要生物体自身的控制。制。【例例2 2】 使使用用pcrpcr仪具体实验操作顺序应为仪具体实验操作顺序应为( () )。设计好设计好pcrpcr仪的循环程序按配方准备好各组分仪的循环程序按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分进行用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分进行pcrpcr反应反应离心使反应液集中在离心管底部离心使反应液集中在离心管底部a a b bc c d d思维导图：思维导图：pcr技术