实验3醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质

1、实验三 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳【实验目的】熟悉醋酸纤维薄膜电泳方法及其在分离血清蛋白中的应用，了解电泳技术的一般原理。 【实验原理】醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样结构，厚度仅120 um,有强 渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白质电泳具有微量、快速、简便 及分辨率较高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。蛋白质是兼性离子。由于组成蛋白质分子的氨基酸种类和数目不同，各种血清蛋白质 的分子量和等电点也不相同。在同一条件下（电场强度、电渗、温度、缓冲液ph和离子强 度等），它们电泳速度各不相同，因而可以分离。本实验以醋酸纤维薄膜为

2、支持物，利用血 清中蛋白质颗粒的等电点大部分低于7,在缓冲液ph8.6中带负电荷，在电场屮向正极移动, 电泳后根据血清蛋白移动快慢，可依次分为清蛋白、球蛋白的5、a 2、3、丫五个区带， 染色后显出清晰色带。由于各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比，可将各色带剪开, 分别溶于碱性溶液中，用分光光度法计算各种蛋白质的百分数，也可以将染色后的膜条直接 用光密度计测定。【实验试剂】1、巴比妥缓冲液（ph8.6,离子强度0.075）:称取巴比妥钠15.45g,巴比妥2.76g,用蒸徭 水配成1000ml o2、染色液：氨基黑10b0.25g,甲醇50ml,冰酷酸10ml蒸餾水40ml混合配制工作液（

3、可 重复使用）。3、漂洗液：95%乙醇45份，冰酷酸5份，蒸徭水50份。4、0.4mol/lnaoh洗脱液：収4克naoh加蒸傭水至250ml。5、透明液：冰醋酸25-30ml加95%乙醇70-75ml6、新鲜无溶血血清。【实验器材】电泳仪（包括整流器与电泳槽）与分光光度计或光密度计、染色缸、醋酸纤维薄膜（2x 8cm）.点样器（宽1,5cm）. 10ml吸管、大试管等、培养皿、滤纸、银子、直尺、铅笔、剪 刀等。【实验操作】1、准备：（1）浸泡醋酸纤维薄膜：用蹑子取2x8cm醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光 泽而，并在角上用笔作上记号），在膜的粗而一端2cm处用铅笔轻划一横线，表示点样位置

4、, 将膜浸入巴比妥缓冲液中充分浸透（约20分钟）。(2) 向电泳槽内倒入巴比妥缓冲液：将巴比妥缓冲液倒入电泳槽的两个电极槽内，槽 内的液面要等高。(3) 制备滤纸桥：取两层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对 齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。该滤纸条即为滤纸桥。它是联系酷酸纤维薄膜和两极 缓冲液之间的桥梁。2、点样：取出浸泡好的醋酸纤维薄膜，将其夹在两层粗滤纸内吸去水分，膜的粗面朝 上平铺在玻璃板上。将点样器浸入蒸憎水中沾湿用吸水纸吸十后再沾血清(改进)，紧印在 膜粗面点样线上使血清全部渗入膜内。3、电泳：将膜点样面向下，两端拉紧贴于电泳槽架的滤纸桥上，点样端靠近阴极，盖 上

5、槽盖，静置平衡510分钟，待醋酸纤维薄膜全部润湿后通电。调节电压。方法1：电压 先90v, 10分钟；120 v ,电流0.4-0.7ma / cm宽，约4560分钟关闭电源。方法2：电压 先160v ,电流0.40.7ma/cm宽，约25分钟关闭电源。若连续数次电泳，每次正负电极 应转换。4、染色与漂洗：电泳完毕，取出膜条，直接浸入氨基黑10b染色液中，染色35分钟 取出薄膜，立即浸入漂洗液屮，时时漂盈，漂洗34次至背景无色为止，用蒸饰水冲洗后放 室温凉干或放100°c以下干燥箱烘干。则得色带清晰的电泳图谱。5、定量：将漂净的膜条上各蛋白色带剪下，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条作

6、空 白对照。将各类膜条分别加入6支大试管中，清蛋白中力u0.4mol/lnaoh6ml (为其它试管 体积的2倍)，其余各加3ml,吋时摇动，置37°c水浴10分钟，使其色泽浸出(注：试管 内加入的naoh溶液根据蛋白质区带染色深浅而泄)。用分光光度讣650nm波长进行测泄， 读取各管的光密度(0d)o如果样本须保留，可将干燥的图谱膜条放入透明液中浸泡23分 钟后取出平贴于干净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱。放40°c温水浸泡5分钟可揭起 膜吸干保存或用光密度计直接测定。6、计算od 总和 t=od (a) x2+od ( a 丨)+od ( a 2)+ od ( b )

7、 + od ( 丫)清蛋白%=2xod (a) /tx100%a 】球蛋白%= od ( a j /tx100%a 2球蛋白%= od( a 2)/tx100%p 球蛋白=% od ( p ) /tx 100%y 球蛋白%=od ( y)tx100%【说明】1、醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白正常值：清蛋白(a)： 55-74%, a i球蛋白2-5%, a2 球蛋白49%, b球蛋白6.5 12%, y球蛋白12-20%，肝硬化时清蛋白显著降低，丫球 蛋白升高23倍，肾病综合征时清蛋白质降低，a 2、b球蛋白升高。2、电压电流、电泳时间、血清加量、醋纤膜质量、染料质量和浓度、染色时间和染料应 用的次

8、数，漂洗的次数及每次间隔的时间、缓冲液的离子强度、透明液的醋酸浓度等都对影 响醋纤膜电泳分析的结果。因此在实验中要注意以下几个问题：（1）醋纤薄膜质量、膜处理和点样技术是避免电泳图谱不齐或分离不良的关键。 要选择质匀、孔细、染料吸附少的薄膜充分浸透缓冲液至湿度均匀无干白点。然后将 滤纸吸去薄膜表面的多余水份，使薄膜含水量饱和均匀，以防薄膜表面液体含量不均，水份 移动而引起标木移位。 点样前注意关闭门窗和风扇，以防由空气流通快使标本和水份蒸发而影响电泳图形 点样前耍先将点样器浸入蒸憾水中沾湿用吸水纸吸干后再沾血清。 点样时血清滴加要均匀迅速，不能滴加过多。（2）点样后薄膜不能过干，电泳槽密封要严

9、，电流、温度要适宜是避免电泳图谱出现条 痕的关键。 点样前薄膜一定要充分浸透。 电泳前要注意检查电泳槽是否盖紧。 电泳槽耍放在远离光源热源的阴凉之处。防止温度过高。 电泳过程中要随时观察电压电流的变化，因通电后产生一定的热量，电流会冇所增 加。控制电压100110v,电流0.50.6ma/cm。 电泳吋间一般冬长夏短，以区带展开3.54cm即可（另加一条漠酚蓝预染血清，同 样操作，指示区带展开的距离）。（3）适宜的缓冲液离子强度、适量的薄膜数量是避免区带拖尾或区带过于紧密的关键。 要及时检查缓冲液的离子强度。缓冲液的离子强度低于0.05即出现区带拖尾现 彖，离子强度0.075则区带过于紧密。此

10、时需要检查更换缓冲液。常规操作一般使用连续 电泳巴比妥盐缓冲液ph8.6,离子强度0.06o 电泳槽中缓冲液经10次使用后，不应简单地采取交换电极的方法，而是将缓冲液取 出重新混合过滤后，再进行使用，一般用4个周期后需更换新液。离子强度愈低，区带展开 愈长，电泳速度愈快。 实验屮发现薄膜愈少，展开的距离愈短，区带愈清晰。因为在仪器输出电压相同的情 况下，薄膜愈少，加在薄膜两端的电压愈高，电压高会使展开的长度缩短。薄膜数量在5 条左右，即可使图谱展开长度有较好的重现性。（4）薄膜要紧压在电泳槽的滤纸桥上，避免区带一边长一边短呈现扭曲现象这是薄膜两边电阻不一样，电阻大的一边电流小，速度慢，区带展开

11、短。造成这种现象 的原因是薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻。在操作过程中， 一定要注意使薄膜两端紧压在滤纸桥上。（5）丫球蛋白区带倒退这是电渗作用引起的。对升高点样端的缓冲液面高度或适当加大电流量克服之。（6）染色时间过短或点样量过多会造成染色后白蛋白中间色浅，可增加染色时间或减少 点样量解决之。（7）标本溶血会造成染色后区带清晰度不良陈旧标本可使区带分离清晰度大为降低。应尽量当日标本当日做，最多不超过2天。 另外标本不可溶血，因溶血标本中血红蛋白与卩球蛋白的电泳区带相重迭。可造成卩球蛋白 含量升高而蛋白质含量相对减少的结果。（8）染色液陈ih会使白蛋白区带染色不均并有空泡这是染色液陈ih所致，染色液存放和使用过久，会降低蛋白质结合染料的能力。发现正 在使用的染液已陈i口时，应立即全部弃去，更换新液。（9）透明时膜发白不能完全透明薄膜未干或透明液屮醋酸含量不足可造成膜发白而不能达到透明的目的，应将薄膜晾 干，