紫花牡荆素对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响.doc

1、南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读（博 / 硕）士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有， 本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使

2、用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅； 学校可以公布学位论文的全部或部分内容， 可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文； 学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程 规定享受相关权益。 同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库 ，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名：年月日导师签名：年月日目录1 2 3().4() . 6 1. . . 6 2. . . . 72.1.72.2A549

3、.82.3A54992.4A549ROS.92.5A54992.6 Western Blotting.92.7.10(). 1 2(). 2 1(). 2 4() . 2 5 . 29 . .50 . 51主要缩略词英文索引缩略词英文全称PIpropidium iodideROSreactive oxygen speciesNACN-acetylcysteineCAScasticinMTT3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli-um bromidePBSphosphate buffered salineFCMflow cytomet

4、ryTAXtaxolDMSOdimethyl sulfoxideCyt-Ccytochrome-cFBSfetal bovine serumSDstandand deviationIC 5050% inhibitory concentrationSASstatistics analysis systemIRinhibition ratioH2DCF2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetateH-DAAabsorbanceJC-15,5,6,6-tetrachloro-1,1 ,3,3-tetrethylbenzimidalyl carbocyanine io

5、dideSPSSstatistical package of social scienceannexin 中文全称碘化丙啶活性氧N- 乙酰半胱氨酸紫花牡荆素溴化四甲基偶氮唑蓝磷酸盐缓冲液流式细胞术紫杉醇二甲基亚砜细胞色素 C小牛血清标准差半数抑制浓度统计学分析系统抑制率2',7'- 二氢二氯荧光素乙二脂吸光度四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物社会科学统计软件膜联蛋白- 1 -紫花牡荆素对人肺腺癌A549 细胞增殖及凋亡的影响摘要目的： 检定紫花牡荆素 (casticin, CAS)是否抑制人肺腺癌A549 细胞增殖活性和诱导细胞凋亡作用；并探讨其作用机制是否涉及活性氧(react

6、ive oxygen species, ROS)生成以及线粒体信号传导途径。方法： 用不同浓度CAS 处理的体外培养A549 细胞，溴化四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoli-um bromide, MTT) 法测定增殖活性；膜联蛋白 (annexin )/碘化丙啶 (propidium iodide, PI)双染色以流式细胞术 (flow cytometry, FCM) 分析细胞凋亡率； 2',7'-二氢二氯荧光素乙二脂 (2,7-dichlorodihydrofluoresceindiaceta

7、te, H2DCFH-DA) 探针以 FCM 分析细胞 ROS 生成；四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物 (5,5,6,6-tetrachloro-1,1 ,3,3-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide, JC-1) 探针以 FCM 分析线粒体跨膜电位； Western Blotting 分析 Bax 蛋白表达和细胞色素C(cytochrome-c, Cyt-C)释放。结果：MTT 法测定结果表明： CAS 能抑制 A549 细胞增殖，呈浓度依赖性和时间依赖性。 Annexin /PI 双染色 FCM 分析结果表明： CAS 能促进 A549 细胞

8、凋亡， N-乙酰半胱氨酸 (N-acetylcysteine, NAC)有抑制 CAS 诱导 A549 细胞凋亡的作用。 H2DCFH-DA 探针 FCM 分析结果表明：CAS 能增加 A549 细胞 ROS 生成水平，NAC 具有有效对抗 CAS 增加 ROS 生成的作用。 JC-1 探针 FCM 分析结果表明： CAS 能降低 A549 细胞的线粒体跨膜电位， NAC 具有减弱 CAS 降低线粒体膜电位的作用。 Western Blotting 分析结果表明： CAS 能促进 A549 细胞 Bax 蛋白表达和 Cyt-C 释放， NAC 具有拮抗 CAS 上调Bax 蛋白表达和促进Cyt

9、-C 释放的作用。结论： 1. CAS 具有抑制 A549 细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。2. CAS 诱导 A549 细胞凋亡的作用机制可能与ROS 生成及线粒体信号传导途径有关。关键词 ：肺癌；紫花牡荆素；增殖；凋亡；线粒体- 2 -Key words:Effects of Casticin on proliferation and apoptosis inhuman lung cancer A549 cellsAbstractObjective: To examine the inhibitory effect of casticin (CAS) proliferation and in

10、ducing apoptosis in human lung cancer A549 cells; and to investigate whether its mechanisms is involved in the generation of reactive oxygen species (ROS) and the mitochondrial signaling pathway.Methods: Human lung cancer A549 cell line was cultured in vitro. 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphe

11、nyltetrazoli-um bromide (MTT) assay measured the proliferative activity of the A549 cells. The apoptosis rates of the cells were observed by flow cytometry (FCM) with annexin /propidium iodide (PI) fluorescence staining. The generation of ROS of the cells was examined by FCM with 2 , 7-dichlorodihyd

12、rofluoresceindiacetate (H2DCFH-DA) fluorescence probe. The mitochondrial membrane potential was detected by FCM with 5, 5 , 6,-tetrachloro6-1, 1 , 3,-tetrethyl3 benzimidalyl carbocyanine iodide (JC-1) fluorescence probe. The release of cytochrome-c (Cyt-C) inmitochondrion and the expression of bax p

13、rotein were analyzed by Western Blotting.Results: MTT assay showed that CAS could inhibit the proliferation activity of the A549 cells in a concentration-dependent and time-dependent manner. The FCM with Annexin/PI indicated that CAS could promote the apoptosis of the cells and N-acetylcysteine (NAC

14、) could inhibit the apoptosis. The FCM with H 2DCFH-DA indicated that CAS could increase the generation level of ROS and NAC could inhibit such effect. The FCM with JC-1 indicated that CAS could reduce the mitochondrial membrane potential and NAC could inhibit such effect. Western Blotting indicated

15、 that CAS could promote the expression of bax and the release of Cyt-C and the function of CAS could be restrained by NAC. Conclusion: 1. CAS has the effect of inhibiting proliferation activity and inducing apoptosis in the A549 cells.2. One of the important mechanisms of the A549 cells apoptosis in

16、duced by CAS involves the generation of ROS and the mitochondrial signaling pathway.Lung cancer; Casticin; Proliferation; Apoptosis; Mitochondrion- 3 -前言肺癌是人类目前所面临的恶性肿瘤中最常见的之一，其发生发展所表现出的病理学过程是由于多种基因的变异和多个内在、 外在因素共同引起的， 贯穿着一系列分子事件变化，包括细胞周期素 D1 与抑癌基因 P16 的异常表达 1 、癌基因 Bcl-2 的过表达、 Ras 基因的突变以及 DNA 损伤修复的突

17、变 2 等，均构成了多基因的发病模型。因此，研究抗肿瘤的各种作用机制，并开发出新型的抗肿瘤药物的现实意义就不言而喻了，目前，抗肿瘤研究的热点， 主要集中在挖掘新型的天然药物上，致力于肺癌发生发展的各个阶段的预防和治疗。近几年来，随着现代医学、生物学、药物化学和药学的不断发展，虽然肺癌的治疗方法已经有手术、放疗、化疗、免疫治疗以及分子靶向治疗等多种方法，但是其预后仍不能令人满意，其 5年生存率仍然不到 15%3 。在我国，肺癌的中医药治疗所表现出的一重大特色，即多靶点治疗，其特点主要是表现在对肺癌病灶的稳定性有较高的治疗率，较好的延长生存期， 较显著的提高生活质量， 并且对因放疗或化疗所带来的不

18、良反应能够有效的减轻 4,5 ，同时具有抑制转移与复发的潜在优势。对于中草药的抗肿瘤作用，目前，国内外许多学者通过提取中草药的有效活性成分处理肿瘤细胞或肿瘤动物移植瘤来进行研究，显示出中药或复方制剂对肺癌有很好的抑制作用，从而体现出在肺癌的综合治疗中，我国的中医药已经成为了不可或缺的重要组成部分。因此，在抗肿瘤药物的开发和研究时， 在众多纯天然植物提取的有效活性物中，找到对于肿瘤细胞能够具有选择性地抑制或杀灭作用，而有较小毒副作用的化合物，就显得格外重要。紫花牡荆素 (casticin, CAS)是一种多甲氧基黄酮类化合物，可以在多种植物的果实或叶子中找到，如马鞭草科植物蔓荆6、香茶菜 8 以

19、及穗花牡荆 7 等，其中以蔓荆中的含量居多，其具有抗炎 9,10 、抗性激素 11和抗肿瘤 12-15等作用，并且是蔓荆子抗肿瘤作用的主要活性成分。 2006 年 Haidara 等 14 发现 CAS 对人乳腺上皮癌和人结肠癌细胞均有抑制作用； 2009 年 Shen 等12 报道了 CAS 对人白血病众多细胞株有抑制作用，但对正常细胞的增殖无影响或影响很小；2010 年陈艳等 16研究发现， CAS 能够促进人宫颈癌 HeLa 细胞的凋亡，其途径可能与刺激活性氧生成有关；此外，还有研究发现CAS对人肝癌 HepG2 细胞 17 、卵巢癌细胞 18等，均可以诱导肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡是在多种

20、基因调控下的严密完整的、主动的、有序的死亡过程。 而肿瘤的产生，与其正常细胞凋亡的抑制或失效密切相关，一方面既能使延长细胞的寿命，堆积- 4 -过多的异常细胞， 另一方面又使已经突变的细胞不能得到清除。 近年来，诱导肿瘤细胞凋亡的研究越来越受到重视。 手术治疗仍然是治疗肺癌首选方法， 术后辅以化疗已成为临床常规方案 19 , 但这依然不能明显改善患者生存期。 由于导致肺癌患者死亡的主要原因是肿瘤的侵袭与转移， 因此，在术后的化疗中寻找能杀伤肿瘤细胞、 抑制肿瘤的侵袭与转移的化疗药物，在肿瘤的治疗中相当重要。有研究报道， 在细胞的生命活动中， 可以看作是其控制中心的线粒体， 在细胞内既行使着氧化

21、磷酸化与细胞呼吸链的作用， 也能够调控细胞的凋亡。 在真核细胞内， 线粒体可以产生腺苷三磷酸， 使细胞的能量代谢得以维持， 进而能使细胞完成正常的功能活动。线粒体内也存在一些物质，与细胞凋亡的关系很密切，比如有细胞色素 C(cytochrome-c, Cyt-C)、活性氧 (reactive oxygen species, ROS)、凋亡诱导因子和 Ca2+等。在凋亡信号的刺激下， 细胞内 Bcl 基因家族的凋亡蛋白得到表达， 使线粒体开放其膜上透性转换孔， 其膜的通透性增加， 最终引发细胞凋亡的关键性步骤， 即线粒体跨膜电位下降 21和 Cyt-C 释放 20 。线粒体经不同信号的刺激，再决

22、定这些事件的激活或是抑制，最终通过其下游的信号通路对细胞的凋亡进行调控 22 。然而，肿瘤细胞大多数处于一个高代谢状态，在细胞线粒体内， 与正常细胞相比较， 呼吸链的转运活性有显著的增高，但是，正是因为肿瘤细胞的这种高代谢， 使得线粒体膜的完整的功能状态受到破坏， 进而，当从线粒体凋亡途径上着手诱导肿瘤细胞凋亡时，作用将更加敏感23。综合以上研究成果，本课题拟综合应用现代实验技术，旨在研究CAS 抑制人肺癌A549 细胞的增殖和诱导其凋亡的作用， 并探讨其作用机制是否涉及ROS 生成以及线粒体信号传导途径， 在找寻新型对抗肺癌并存在潜在开发前景的药物的道路上，尝试着提供一些有效的实验依据。-

23、5 -材料和方法1材料1.1细胞株与细胞培养南华大学附属第一医院肿瘤外科惠赠得到人肺腺癌A549 细胞株；进行培养的培养基是 RPMI-1640 培养基，并在其中添加10%的新生小牛血清 (fetal bovine serum, FBS)，放置于含 5%CO2 的饱和湿度培养箱中培养，调整温度至37。1.2药品与试剂CAS 相对分子量为 374.3，淡黄色粉末， 纯度 >98%，从成都普瑞法科技开发公司购得；PRMI-1640 培养基从 Gibco 公司（美国）购得； FBS 从杭州四季青生物工程材料有限 公 司 购 得； 二甲 基亚 砜 (dimethylsulfoxide,DMSO)

24、 和 溴 化 四 甲 基 偶氮 唑 蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, MTT) 从 Amresco 公司（美国）购得；紫杉醇 (taxol, TAX) 从山西振东泰盛制药有限公司购得；抗 Bax 蛋白抗体与抗 Cyt-C 抗体均为兔抗人单克隆抗体， 从 Epitomics 公司购得；膜联蛋白 (annexin )/ 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)凋亡检测试剂盒从南京凯基公司购得； 活性氧检测试剂盒（ 2',7'-二氢二氯荧光素乙二脂 (2,7-dichlorodi

25、hydrofluorescein diacetate, H2DCFH-DA) 探针）与线粒体膜电位检测试剂盒（四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5 ,6,6-tetrachloro-1,1 ,3,3-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide, JC-1) 探针）均购自美国 Molecular Probes Inc 公司；电泳及染色试剂（丙烯酰胺、 Bis、 APS、甘氨酸、 Tris 碱、 SDS、TEMED 、考马斯亮蓝 R-250、溴酚蓝）购自上海生物工程公司； PVDF 膜购自 Minipore 公司；余为国产分析纯试剂。1.3主要仪器CO

26、2 细胞培养箱：由 SHEL-LAB 公司（美国）生产高速低温离心机：由SIGMA 公司（德国）生产，型号为4K15倒置显微镜：由OLYMPUS 公司（日本）生产皿式分析电子天平：由上海天平仪器厂生产，型号为HANGPINC JA1003超低温冰箱：由SANYO 公司（日本）生产电子 PH 仪：由 Beckman 公司（美国）生产高速离心机：由Eppendorf 公司（德国）生产，型号为5804流式细胞仪：由Coulter 公司（美国）生产，型号为EPICS-XL ，Cell quest 软件分析- 6 -各种培养器皿、培养瓶、96 孔培养板等：由Becton Dickinson 公司（美国）

27、生产稳压稳流电泳仪：由北京市六一仪器厂生产，型号为DYY-8BEppendorf 加样器：由 Eppendorf 公司（德国）生产酶联免疫检测仪：由上海富众生物科学有限公司生产，型号为ELX-800去离子水纯化仪：由USF E1GA 公司（德国）生产医用超净工作台：由苏州净化设备公司生产，型号为YJ-875光学显微镜：由OLYMPUS 公司（日本）生产Heto-Holten 冷水循环仪：由Gyde Vomg17-19 3450 Allerod 公司（丹麦）生产2 方 法2.1 实验液的配制2.1.1 PBS ：用双蒸去离子水溶解KCl 粉 0.2g、NaCl 粉 8.0g、KH 2PO4 粉

28、0.24g 和 Na2HPO4·12H2O粉 3.63g，PH 值调整至 7.4，再加双蒸去离子水定容量于1000ml，接着在 121的高压锅内灭菌 20min，最后保存于 4的冰箱内。2.1.2受试物的配制称取 CAS 粉末 10.22mg，在超净工作台下用无菌 DMSO 0.5ml 充分溶解后，加磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline, PBS)，即配成浓度为 3mmol/L 的 CAS 母液 10ml。取母液 100l，加 PBS 900l，即配成浓度为 300mol/L 的工作液；取浓度为 300mol/L 的工作液 333l，加 PBS 666l

29、，即配成浓度为 100mol/L 的工作液；取浓度为 100mol/L 的工作液 100l，加 PBS 900l，即配成浓度为 30mol/L 的工作液； 取浓度为 30mol/L 的工作液 100l，加 PBS 900l，即配成浓度为 10mol/L 的工作液； 取浓度为 10mol/L 的工作液 100l，加 PBS 900l，即配成浓度为 3mol/L 的工作液；取浓度为 3mol/L 的工作液 100l，加 PBS 900l，即配成浓度为 1mol/L 的工作液；将上述母液和工作液置于 4冰箱中保存。2.1.3对照药品的配制：TAX 规格为 30mg/5ml/支，批号为 0604131

30、。在无菌操作台内，用 2242l 的 PBS 稀释 TAX 原液 100l，配成 0.3mmol/L 的 TAX 液母液 2.342ml；取母液 100l，加 PBS 900l，即配成浓度为 30mol/L 的工作液，将上述母液和工作液保存于 4的冰箱内。2.1.4 RPMI-1640 培养基：取 1000ml 蒸馏水溶解 RPMI-1640 培养基粉 10.4g，加入 NaHCO3 粉 2g，然后用适- 7 -量 HCl 调整 pH 值至 7.0，通过 0.22 m 微孔滤膜抽滤除菌，最后保存于4的冰箱内，临用时加 10%FBS。2.1.5 FBS ：FBS 在 56水浴中灭活 30min

31、后，分装保存于 -20的冰箱内。2.1.6胰蛋白酶：用 100ml PBS 溶解胰蛋白酶粉 0.25g，再通过 0.22 m 微孔滤膜进行抽滤除菌，最后保存于 4的冰箱内。2.1.7 MTT ：用 1ml PBS 溶解 MTT 粉 5mg，再通过 0.22 m 微孔滤膜进行抽滤除菌，最后保存于 4的冰箱内。使用期限为 2 周。2.2 MTT 比色法测定 CAS对人肺癌 A549细胞增殖活性的影响：参考文献所述方法 24 ，用完全培养基调整处于对数生长期的A549 细胞浓度至 6×4180l，经 4-6h 的培10 /mL 后，在 96 孔细胞培养板中继续培养，每孔含细胞的培养基养，当

32、细胞贴壁以后，分5 组分别加入终浓度为 0.3、1.0、3.0、10.0、30.0mol/L 的CAS 液 20l，分别作用14A549 细胞 48h；阳性对照药组，加入终浓度为 1.0 mol/L 的TAX ，作用 A549 细胞 48h；溶媒对照组，加入终浓度为0.1%的 DMSO ，作用 A549 细胞 48h，每组设置复孔 4 个，每孔加已配置好的浓度为5g/L 的 MTT 液 20l，继续培养4h 于培养箱中，吸去培养基，在每孔内加 DMSO 100 l，震荡 10min，充分溶解紫蓝色沉淀，经酶联免疫检测仪于 570nm 波长测定吸光度 (absorbance, A)值，按公式 2

33、5 ：抑制率 (inhibition ratio, IR) (1实验组 A 均值 /对照组 A 均值 )×100%计算相对增殖抑制率，用统计学分析系统 (statistics analysis system, SAS) 软件计算出半数抑制浓度(50%inhibitory concentration, IC 50)值。以上实验重复3 次。用完全培养基调整处于对数生长期的A549 细胞浓度至 6× 104/mL 后，在 96 孔细胞培养板中继续培养，每孔含细胞的培养基180l，经 4-6h 的培养，当细胞贴壁以后加入 20l终浓度接近 IC50 值的 CAS 液，分别作用 A5

34、49 细胞 24h、48h、72h；溶媒对照组，加入终浓度为 0.1%的 DMSO ，作用 A549 细胞 48h；N-乙酰半胱氨酸 (N-acetylcysteine, NAC) 干预实验组，待细胞贴壁后用 10mmol/L 的 NAC 预孵育细胞 1h，加入 20l接近IC50 值浓度 CAS 液继续作用 A549 细胞 48h，每组设置复孔 4 个，每孔加已配置好的浓度为 5g/L 的 MTT 液 20l，继续培养 4h 于培养箱中，吸去培养基，在每孔内加 DMSO 100l，震荡 10min，充分溶解紫蓝色沉淀， 经酶联免疫检测仪于 570nm 波长测定 A 值。- 8 -以上实验重复

35、 3 次。2.3 Annexin/PI 双染色 FMS分析 CAS对人肺癌 A549细胞凋亡的影响参考文献所述方法26，用完全培养基调整处于对数生长期的A549 细胞浓度至 6×410 /mL后，在250ml的培养瓶中继续培养 4-6h，当细胞贴壁以后加入终浓度接近IC50值的14CAS液，分别作用 A549 细胞 12h、24h、 48h；阳性药物组，加入终浓度为1.0 mol/L的 TAX ，作用 A549细胞 48h；溶媒对照组，加入终浓度为 0.1%的DMSO ，作用 A549细胞48h；NAC 干预实验组，待细胞贴壁后用10mmol/L 的 NAC 预孵育细胞 1h，加入终

36、浓度接近 IC50值的 CAS继续作用 A549细胞 48h，收集 2.0×106个受试物处理后的 A549细胞，冷PBS洗2遍，经annexin 和 PI双染色 27，用流式细胞仪检测细胞凋亡率28 。以上实验重复 3次。2.4 H 2DCFH-DA探针 FCM分析 CAS对人肺癌 A549细胞 ROS生成的影响用完全培养基调整处于对数生长期的A549 细胞浓度至 6×104/mL 后，在 250ml 的培养瓶中继续培养4-6h，当细胞贴壁以后加入终浓度接近IC50 值的 CAS 液，分别作用A549 细胞 12h、24h、48h；溶媒对照组，加入终浓度为0.1%的 DM

37、SO ，作用 A549 细胞 48h；NAC 干预实验组，待细胞贴壁后用10mmol/L 的 NAC 预孵育细胞 1h，加入终浓度接近 IC50 值的 CAS 液继续作用 A549 细胞 48h，收集 2.0×106 个受试物处理后的A549 细胞，用无血清培养基清洗三次，重悬于1ml 的 H2DCFH-DA 探针中， 37暗室作用 30min，用流式细胞仪以488nm 为激发波长， 525nm 为发射波长测定细胞内的荧光强度。以上实验重复3 次。2.5 JC-1 探针 FCM分析 CAS对人肺癌 A549细胞线粒体跨膜电位的影响用完全培养基调整处于对数生长期的A549 细胞浓度至

38、6×104/mL 后，在 250ml 的培养瓶中继续培养4-6h，当细胞贴壁以后加入终浓度接近IC50 值的 CAS 液，分别作用A549 细胞 12h、24h、48h；溶媒对照组，加入终浓度为0.1%的 DMSO ，作用 A549 细胞 48h；NAC干预实验组，待细胞贴壁后用 10mmol/L 的 NAC 预孵育细胞 1h，加入终浓度接近 IC50值的 CAS 液继续作用 A549 细胞 48h，收集经受试物作用的 2.0×106 个细胞，用 PBS 洗 2 遍，重悬于终浓度为 5g/mL的 JC-1 染色液中， 37避光作用 30 分钟，再用 PBS 洗涤 2 遍，调

39、试流式细胞仪至 475nm 激发波长和 525nm 发射波长后，对线粒体中 JC-1 所表现的红、绿色的荧光强度进行检测。以上实验重复3 次。2.6 Western Blotting检测分析2.6.1 CAS 对人肺癌 A549细胞线粒体 Cyt-C 释放的影响- 9 -用完全培养基调整处于对数生长期的A549 细胞浓度至 6×104/mL 后，在 250ml 的培养瓶中继续培养4-6h，当细胞贴壁以后加入终浓度接近IC50 值的 CAS 液，分别作用A549 细胞 12h、24h、48h；溶媒对照组，加入终浓度为0.1%的 DMSO ，作用 A549 细胞 48h；NAC 干预实验

40、组，待细胞贴壁后用10mmol/L 的 NAC 预孵育细胞 1h，加入终浓度接近 IC50 值的 CAS 液继续作用 A549 细胞 48h，收集 2.0×106 个受试物处理后的A549 细胞，用 PBS 洗 3 遍，经细胞裂解液裂解后，在 4下 13000rpm 离心 10min，再收集细胞的总蛋白，经 BCA 蛋白浓度测定试剂盒处理后，在酶联免疫检测仪上定量检测每个样本的蛋白量。把等体积的上样缓冲液加入到总蛋白为40g/泳道的蛋白样品中，置于 100沸水中 5min，经 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳 3h，待蛋白样品转移至 PVDF膜上。在室温下，用含 5%脱脂牛奶的 TBST 液

41、对 PVDF 膜封闭 2h，再在室温下加入Cyt-C(1:500)孵育 2h 后，用 TBST 液洗 3 遍，每遍洗 10min，然后用相应的二抗继续孵育，用 TBST 液再次洗涤 PVDF 膜 3 遍，每遍洗 15 min 后，最后用化学发光剂 A、 B处理激发荧光，在暗室中压片、显影、定影29,30 。以上实验重复 3 次。2.6.2 CAS 对人肺癌 A549细胞 Bax 蛋白表达的影响用完全培养基调整处于对数生长期的A549 细胞浓度至 6×104/mL 后，在 250ml 的培养瓶中继续培养4-6h，当细胞贴壁以后加入终浓度接近IC50 值的 CAS 液，分别作用A549

42、细胞 12h、24h、48h；溶媒对照组，加入终浓度为0.1%的 DMSO ，作用 A549 细胞 48h；NAC 干预实验组，待细胞贴壁后用10mmol/L 的 NAC 预孵育细胞 1h，加入终浓度接近 IC50 值的 CAS 液继续作用 A549 细胞 48h，收集 2.0×106 个受试物处理后的 A549 细胞，用 PBS 洗 3 遍，经细胞裂解液裂解后，在 4下 13000rpm 离心 10min，再收集细胞的总蛋白，经 BCA 蛋白浓度测定试剂盒处理后，在酶联免疫检测仪上定量检测每个样本的蛋白量。把等体积的上样缓冲液加入到总蛋白为40g/泳道的蛋白样品中，置于 100沸水

43、中 5min，经 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳 3h，待蛋白样品转移至 PVDF 膜上。在室温下，用含 5%脱脂牛奶的 TBST 液对 PVDF 膜封闭 2h，再在室温下加入 Bax 蛋白 (1:500)孵育 2h 后，用 TBST 液洗 3 遍，每遍洗 10min，然后用相应的二抗继续孵育，用 TBST 液再次洗涤 PVDF 膜 3 遍，每遍洗 15 min 后，最后用化学发光剂 A 、B处理激发荧光，在暗室中压片、显影、定影29,30 。以上实验重复 3 次。2.7 统计学处理实验数据录入社会科学统计软件包(statistical package of social science, SPSS

44、)13.，0建立数据库，采用均数 ±标准差 ( x ±SD)表示各组的实验数据，并用单因素方差统计分析。在-10-对照组和实验组均数间进行比较时采用LSD 法，在各组均数之间进行两两比较时采用SNK 法，定义 P<0.05 为具有统计学意义。-11-结 果1. MTT 比色法测定 CAS对人肺癌 A549 细胞增殖活性的影响MTT 比色法测定结果显示， A549 细胞被 CAS（不同浓度）作用48h 后， CAS 能抑制细胞的增殖，并呈现浓度的依赖性，对比溶媒对照组，差异具有统计学意义 (P<0.05)。在各 CAS（不同浓度）组之间行对比，各组间所表现的细胞增

45、殖抑制率差异也具有统计学意义 (P<0.05)。经实验后还发现， CAS(30.0mol/L)组与 TAX(1.0mol/L)组相比，差异有统计学意义 (P<0.05)，但相比其他浓度 CAS，与 TAX(1.0mol/L)组细胞增殖抑制作用相近的是 CAS(30.0mol/L)组。经计算，得到 CAS 的 IC50 值为 10.32 mol/L。（见表 1，图 1）表 1MTT 比色法测定不同浓度CAS 对 A549 细胞增殖活性的影响药物浓度 ( mol/L)A570( x±IRSD)DMSO0.11.455 ±0.224CAS0.31.337 ±

46、0.046 *8.691.01.157 ±0.070 *21.703.01.030 ±0.037 *30.8410.00.709 ±0.057 *54.0430.00.589 ±0.030 *#62.26TAX1.00.449 ±0.200 *73.08注：* ，示与溶媒组比较P<0.05；#，示与 TAX 组比较 P<0.05；数据为 3 次实验的x ±SD，n=3，t=48h-12-图 1MTT 比色法测定不同浓度CAS 对 A549 细胞增殖活性的影响注： * ，示与溶媒组比较P<0.05； #，示与 TAX

47、组比较 P<0.05；数据为3 次实验的x ±SD， n=3MTT 比色法测定结果显示， 与溶媒对照组相比， 用 CAS(10 mol/L)处理 A549 细胞不同时间段，抑制 A549 细胞增殖的作用加强， 并呈现时间的依赖性， 对比溶媒对照组，差异具有统计学意义 (P<0.05)；用 NAC(10mmol/L) 预孵育细胞 1h 后， CAS(10 mol/L) 处理 A549 细胞 48h，可以发现 NAC 能减弱 CAS 抑制 A549 细胞的增殖作用，与 CAS 单纯作用细胞 48h 比较，差异有统计学意义 (P<0.05)。（见表 2，图 2）表 2MT

48、T 比色法测定 CAS 作用 A549 细胞不同时间段对细胞增殖活性的影响药物时间 (h)A 570x ±抑制率(SD)DMSO (0.1%)481.446 ±0.027CAS (10 mol/L)241.043 ±0.024 *27.87480.698 ±0.022 *51.73720.519 ±0.006 *64.11NAC+CAS480.829 ±0.009 #42.67注： NAC+CAS ：NAC(10mmol/L)预孵育细胞 1h后，加入 CAS(10 mol/L) 继续作用A549 细胞 48h；* ，示与溶媒组比较P&

49、lt;0.05 ； #，示与 CAS(48h) 组比较 P<0.05 ；数据为3 次实验的x ±SD， n=3-13-图 2MTT 比色法测定CAS 作用 A549 细胞不同时间段对细胞增殖活性的影响注： NAC+CAS ：NAC(10mmol/L) 预孵育细胞1h 后，加入 CAS(10 mol/L) 继续作用A549 细胞 48h；* ，示与溶媒组比较 P<0.05 ； #，示与 CAS(48h) 组比较 P<0.05 ；数据为 3 次实验的 x ±SD， n=32. Annexin /PI 双染色 FCM分析 CAS对人肺癌 A54 细胞凋亡的影响Annexin /PI双染色 FCM 分析结果表明， 溶媒对照组、 CAS(10 mol/L)对A549细胞作用不同时间段 (12h、24h、48h)组；TAX(1.0