镉对河蟹抗氧化酶活性的影响

1、    镉对河蟹抗氧化酶活性的影响    赵亚玲 蔺翠翠摘 要：本文采用生态学单因子梯度试验方法，将河蟹暴露于不同cd2+浓度（0、0.5、1.15、3.17毫克/升）96小时，研究镉对河蟹肝胰腺和鳃的超氧化物歧化酶（sod）、过氧化氢酶（cat）和谷胱甘肽硫转移酶（gst）酶活性的影响和损伤，旨在探明重金属镉对抗氧化酶系统的影响。结果显示：河蟹体内抗氧化系统对镉胁迫较为敏感，其抗氧化酶活性的变化可以灵敏地反应镉的胁迫程度和毒性，随着镉胁迫时间和浓度的增加，三种酶的活性呈现出先被激活后被抑制的规律。关键词：镉;河蟹;抗氧化酶河蟹，学名中华绒螯蟹，属软甲纲

2、（malacostraca），十足目（decapoda），弓蟹科（varunidae），绒螯蟹属，集中分布于我国北至辽宁，南至福建闽江口，是我国特有的大型淡水蟹类。河蟹因其个大体肥、膏满黄多、肉质鲜嫩而深受我国广大消费者的青睐。肝胰腺和鳃是河蟹的两大重要器官，肝胰腺是河蟹体内重要的解毒器官，发挥着降低和消除外源有害物质的作用;鳃是河蟹体内重要的呼吸器官，发挥着调节体内渗透压和平衡离子的作用。酶是生物体中一类生物大分子的总称，在呼吸、运动、消化、吸收、代谢、生殖等所有生命活动中起着举足轻重的作用，酶活的变化能快速且灵敏的反映环境胁迫对生物体的影响。镉是一种蓝白色金属，由于其密度大于4.5克/立方

3、厘米，被归类为重金属。重金属镉是当今世界上三大重点研究的毒素之一。早在1984年，镉就位列联合国环境规划署提出的12种具有全球性意义的危害化学物质之首。国际癌症研究机构（iarc）将其归为人类和实验动物中肺癌和前列腺癌的确认致癌物。大部分镉化物可溶于水，通过呼吸、消化、体表渗透等途径被吸收到水生生物体内，引起水生生物的急慢性反应。进入水生生物体内的镉离子，通过诱导作用使水生生物产生大量氧自由基（ros），导致机体受损。生物体内的抗氧化系统是机体的重要防御系统，是清除外源物质产生的氧自由基的第一道防线。为了探明重金属镉对抗氧化酶系统的毒性影响程度与致毒机制，本文就不同浓度镉对河蟹肝胰腺和鳃组织细

4、胞中超氧化物歧化酶（sod）、过氧化氢酶（cat）和谷胱甘肽硫转移酶（gst）酶活性的影响进行了研究，为水产品的安全养殖提供科学依据。1 材料与方法1.1 仪器与试剂电动匀浆机（ika tigital）、电子天平（sartorius，cp224s）、均质器（ika t18 digital）、低温冷冻离心机（tgl-20b）。镉标准品：浓度为1000毫克/升，购于国家有色金属及电子材料分析测试中心。1.2 实验动物河蟹：盘锦水产技术推广站提供，平均湿重（50.3±0.52）克，雌雄各半，放入塑料养殖箱（42厘米×31厘米×26厘米）中暂养5天，选择大小适宜、健康无病

5、、活动正常的河蟹150只备用。1.3 实验设计本课题组在前期对镉引起的河蟹半致死量（ld50）的研究基础上，将本文酶活实验设计为3个添加组和1个空白组，3个添加组的浓度分别为0.5、1.15和3.17毫克/升，每个浓度组设2个平行。实验采用42厘米×31厘米×26厘米大小的塑料养殖箱并上覆薄膜封口以保证养殖水体中镉浓度的恒定，各养殖箱中加入5升含有不同浓度镉的养殖水，水温（21±2），溶解氧>8.0毫克/升，自然光照，连续充气增氧。实验期间不喂食，及时清理死亡个体。1.4 实验方法样品制备：镉胁迫96小时之后，每个平行组随机选取35只河蟹，迅速取出肝胰腺和鳃

6、，在玻璃匀浆器中加入9倍体积的预冷生理盐水，冰浴匀浆组织10分钟，匀浆后于离心机上离心10分钟（2500rpm），上清液冷冻保存用于测定酶活。酶活测定：采用“南京建成”试剂盒测定sod、cat和gst酶活和总蛋白量，酶活单位为u/毫克蛋白。1.5 数据统计结果采用2平行组的平均值±标准差（mean±sd）表示，显著性检验用spss18.0软件进行单因素方差分析（anova）和多重比较（duncan法），差异显着临界值为0.01。2 结果2.1 镉对河蟹肝胰腺和鳃sod酶活性的影响不同浓度镉对河蟹肝胰腺和鳃的sod酶活性影响见图1。肝胰腺空白组的sod酶活为106u/毫克蛋白

7、，低浓度组（0.5毫克/升）酶活为158u/毫克蛋白，显著高于对照组（p2.2 镉对河蟹肝胰腺和鳃cat酶活性的影响不同浓度镉对河蟹肝胰腺和鳃的cat酶活性影响见图2。与sod类似，镉胁迫后肝胰腺和鳃的cat酶活性也发生了明显的变化，总体规律为先激活后抑制，由图2可以看出，低浓度组（0.5毫克/升）肝胰腺和鳃中cat酶活均有明显升高，分别为6.6和6.3u/毫克蛋白，显著高于空白组（p2.3 镉对河蟹肝胰腺和鳃gst酶活性的影响不同浓度镉对河蟹的肝胰腺和鳃gst酶活影响见图3。镉对河蟹肝胰腺gst酶活的影响趋势与sod和cat相似，对照组gst酶活为132u/毫克蛋白，低浓度组酶活为163u/

8、毫克蛋白，与对照组相比差异显著（p3 讨论镉是一种常见的环境污染物，能够刺激生物体产生大量的活性氧。sod是生物体防御内外环境中氧自由基（o2-）侵害的第一道防线，能够灵敏反映外界对生物体的损伤。本文结果显示，随着镉胁迫浓度的升高，河蟹肝胰腺和鳃中sod活性呈现出先被激活随后被抑制的趋势，这与李涌泉、王兰等的研究结果一致。sod为底物诱导酶，低浓度的镉胁迫致使河蟹体内产生大量o2-诱导sod大量产生以清除o2-对机体造成的损害，因此，低浓度的cd诱导sod活性增强。中高浓度组的cd2+能够与河蟹体内细胞质和线粒体中cu/zn-sod和mn-sod发生置换，形成cd-sod改变其分子构想，致使s

9、od酶活降低。过氧化氢酶（cat）在机体清除多余的自由基过程中扮演着重要的角色，低浓度镉胁迫时，河蟹体内h2o2和羟自由基（-ho）含量增加，sod酶被激活的同时，cat合成被激活，共同清除过量h2o2保护机体。本实验同样得出，当河蟹受到低浓度镉胁迫时sod酶活升高，同时cat酶被激活，其酶活高于空白组50%以上，这与其他甲壳类动物的研究结果也保持一致，从cat和sod的作用机理同样可以得出两类酶活变化应保持同步的结论。然而，随着镉胁迫浓度的升高，cat活力未降低至空白组以下，而是维持在空白组的酶活范围内，这可能与镉未对cat造成類似sod分子构想的改变的影响有关。gst是一类多功能解毒酶，gst的多功能性使它在机体解毒代谢中起着十分重要的作用。特定的gst亚基对致癌性异生物质有特异的高催化活性，能够催化gsh（谷胱甘肽）与机体中被氧化的-sh反应使其再生。本实验结果显示，低浓度的cd2+对gst酶活表现出激活作用，此时gst能够与低浓度的cd2+结合，从而降低对河蟹机体的氧化损伤，但随着cd2+浓度的升高，cd2+的累积毒性增加，原有gst活性中心遭到严重破坏，新的gst难以