硫磺熏蒸金银花中断马钱子酸亚硫酸衍生物产生机制探析

1、硫磺熏蒸金银花中断马钱子酸亚硫酸衍生物产生机制探析摘要为了探讨硫磺熏蒸金银花中断马钱子酸亚硫 酸衍生物的生成机制，该研究采用柱色谱技术从未硫熏金银 花中目标性制备分离了断马钱子酸以进行后续模拟反应，断 马钱子酸在有水条件下与二氧化硫反应生成了其亚硫酸衍 生物，反应机制可能涉及了断马钱子酸的酯化反应或者是酸 化开环后亚硫酸根对疑基的加成反应。该研究为支持硫磺熏 蒸导致金银花中断马钱子酸转变成其亚硫酸衍生物提供了 实验依据。关键词硫磺熏蒸；金银花；断马钱子酸金银花为常用大宗中药材，来源于忍冬科植物忍冬 lonicera japonica thunb.的干燥花蕾或待初开的花，自 1963年为历版中国

2、药典所收载。金银花具有清热解毒， 疏散风热之功效，用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢， 风热感冒，温病发热等1。其化学成分包括挥发油、酚酸 （主要为绿原酸及其衍生物）、环烯瞇菇（断马钱子酸、马 钱昔、当药昔及其衍生物）和黄酮类（芦丁、木犀草昔等）。 现代药理研究表明金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、 抗氧化、增强免疫力、解热抗炎和利胆保肝等作用2。传 统的产地加工方法有晒干和阴干，现代加工方法有烘干、水 蒸气干燥、热风干燥以及热风-微波联用等，1995年版中 国药典曾收载过硫磺熏蒸的处理方法，在2000年版之后 的中国药典均取缔了该产地加工方法，然而，在某些主 产区，有时仍会采用硫磺熏蒸以获

3、得良好的外观色泽和防止 虫蛀。前期研究表明硫磺熏蒸能够导致金银花中环烯瞇菇类 主成分断马钱子酸1的含量降低，同时生成其亚硫酸衍生物 243,见图lo断马钱子酸是一种分子结构中具有半缩醛 释基的环烯瞇菇类成分，为金银花含有的环烯瞇菇类物质中 的主要成分4,含量远远高于马钱昔和当药昔及其二聚产 物，其含量的变化有可能会引起金银花与环烯瞇菇类成分相 关的药理活性的改变，譬如抗炎、抗病毒、保肝利胆等。为 了进一步验证硫熏金银花中断马钱子酸亚硫酸衍生物的生 成机制，该研究采用柱色谱技术从未熏金银花中目标性制备 断马钱子酸作为反应底物，将其在有水条件下与s02反应， tlc和hplc监测反应进程，基于lc

4、-ms提供的质谱信息，与 文献数据比对，鉴定生成的化合物结构。1材料shimadzu lc-20a高效液相色谱仪（日本岛津）、agilent 1200-6130系列液 相色谱-质谱 联用仪（agilent technologies）.大容量冷冻离心机（dl-6mb, 长沙英泰仪 器有限责任公司）.sigma 1-14小型离心机（germany）、eyela n-1100旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、裕华hh-s型 水浴锅（巩义市裕华仪器有限责任公司），hz85-1型磁力搅 拌器（北京中兴伟业仪器有限公司）、三口瓶、双连球等。色谱甲醇、色谱乙睛（fisher, usa）,娃哈哈纯净水 （杭

5、州娃哈哈集团有限公司），其他试剂均为分析纯。新鲜的金银花于2012年5月采自山东济南，经中国中 医科学院中药研究所王智民研究员鉴定为忍冬科植物忍冬l. japonica的花蕾。晒干样品：新鲜金银花摊开晾晒于太阳下 至干燥即得；硫磺熏蒸样品：新鲜金银花摊开放于支架上的 透气金属网筛中（不宜太厚），支架下端用铁质器具装入一 定量硫磺粉末，点燃硫磺粉末出现蓝紫色火焰，将整个装置 用塑料布密封，使硫磺黄色烟雾充满装置，熏制过夜，熏制 后的金银花晾于阴凉处，阴干即得。2方法与结果2.1断马钱子酸的分离制备前期研究表明，晒干金银花样品中断马钱子酸的含量较高3,因此选择晒干样品进行该化合物的目标性分离制备。

6、干燥的金银花样品（粉碎，311 g）用17 l 50%乙醇渗漉提取，渗漉液回收溶剂至无醇味（约2 300 ml）,离心（3 500 r min-1, 20 min）,上清液（约 2 100 ml）上 hpd-100 大 孔吸附树脂柱，依次用5倍柱体积的水，10%, 20%, 30%, 40%, 95%乙醇洗脱，tlc和hplc进行流分检查，20%, 30% 乙醇洗脱部分富集断马钱子酸，合并后得10.3 g固体粉末, 上硅胶柱（300400目，氯仿-甲醇-水15 ： 4 ： 0.4）进行 粗分，0ds柱纯化（10%甲醇洗脱），得到单体化合物（277 mg）o 经hplc面积归一化法检测其纯度为9

7、4%；经hplc比对保留 时间，在线紫外吸收以及质谱数据，确证该化合物为断马钱 子酸。晒干金银花50%甲醇超声提取液和断马钱子酸在同一 色谱条件下的hplc图见图2o kromasil c18柱（4. 6mmx250 mm, 5 um）,流动相为1. 4 %甲酸水（a）和乙睛（b）,梯度 洗脱（020 min, 3%8%b； 2045 min, 8%15% b； 45 60 min, 15%24% b； 6070 min, 24%40% b）,检测波 长 254 nm,流速 1 ml min-1,进样量 10 u l,柱温 30 °c。2. 2断马钱子酸在有水条件下与s02反应新鲜的

8、金银花经硫磺熏蒸后断马钱子酸1大部分被破 坏，生成其亚硫酸衍生物243,推测是断马钱子酸结构 中的半缩醛基团与熏蒸过程中硫磺燃烧产生的s02在有水的 条件下发生反应所致；同时通过2007, 2012年采集制备的 硫磺熏蒸金银花样品的hplc图比对发现，在不同批次样品 中化合物24的含量比例不同3, 5,推测是熏蒸过程中 断马钱子酸与s02接触程度不同。因此，开展了以下实验进 行验证。2. 2. 1 反应 1 na2s203 溶液（3 mol l-1）与 h2s04 （3 mol l-1）水浴40 °c反应生成的s02气体通入装有20 ml 水的三角瓶中，待检测到水溶液呈酸性（ph=l

9、）时加入断马 钱子酸固体粉末20 mg,磁力搅拌器不断搅拌，使之混合均 匀，密封保温放置15 h,回收溶剂至干，甲醇复溶，按照 2. 1项下的hplc条件进行检测，产生了化合物2, 3,见图3o 2. 2.2反应2在断马钱子酸水溶液(1 g l-1)中通入由 na2s203 溶液(1 mol - l-1)与 h2s04 (3 mol l-1)水浴 40 °c生成的s02气体，每隔1 h取样200 ul,按照2. 1项 下的hplc条件进行检测，反应底物断马钱子酸与产物的hplc 图见图4,两者峰面积随时间的变化见图5, 5h后断马钱子 酸完全转化成为化合物2。2.2.3反应3在断马钱

10、子酸水溶液(3g - l-1)中通入 由na2s203 (固体)与h2s04 (浓)水浴40 °c生成的s02气 体，每隔2 min取样200 pl,按照2. 1项下的hplc条件进 行检测，反应底物断马钱子酸与反应产物的hplc图见图6, 两者峰面积随时间的变化见图7, 2 min后断马钱子酸完全 转化成为化合物2o2. 2.4亚硫酸衍生物的hplc和lc-ms确认 基于相同色 谱条件下hplc-dad分析提供的保留时间和在线紫外全波长 光谱，与文献比对，反应1生成了亚硫酸衍生物2, 3o由于 化合物2非常不稳定，在回收去除溶剂的过程中会转变为脱 s02的产物(tr=4648 mi

11、n),反应2和3采用反应后直接 进行hplc分析，只检测到化合物2生成。除了保留时间和 在线紫外光谱，负离子模式下的液质联用分析也提供了化合 物2的准分子离子峰455m-h-和911 2m-h-以及碎片离子 峰 373m-s02-h20-h-,与文献数据一致3。3讨论断马钱子酸是一种分子结构中具有半缩醛務基的环烯 瞇菇类成分，曾经从忍冬科金银花l. japonica thunb.、蓝 果忍冬 l. coerulea linn.和长 白忍冬 l. ruprechtiana regel等植物中分离得到，在不同批次晒干和硫熏金银花中 的质量分数分别为0. 79%2. 63%, 0. 20%1. 25

12、% （未发表数 据），为金银花中环烯瞇菇类物质中的主要成分，其含量的 变化有可能会引起金银花与环烯瞇菇类成分相关的药理活 性的改变，比如抗炎、抗病毒、保肝利胆等。由于该物质水 溶性强，缺少市售对照品的供应，本研究探索了从晒干金银 花中富集、制备该成分的工艺流程，能够实现快速、批量制 备该物质，为后续反应进行提供了物质保障。braverman等报道了硫熏食品中普遍存在s02与糖类物 质的反应，与开链醛糖反应涉及了亚硫酸根对疑基的加成反 应，而与环状半缩醛糖类的反应涉及酸脱释基醇脱氢的酯化 反应6-7 o在2.2.1项中，断马钱子酸粉末加入到s02的 水溶液中，固体粉末在溶解的过程中即与亚硫酸反应

13、，产生 了化合物2和3,说明此过程既有半缩醛轻基的酯化反应， 也有断马钱子酸先水解后产生开链醛糖中间体，然后涉及亚 硫酸根对炭基的加成反应，推测的反应历程见图8o 2.2.2 和2. 2.3项表明，若将断马钱子酸先溶于水，然后不间断通 入s02气体，只有化合物2产生，说明断马钱子酸在酸性环 境中不稳定，易发生水解，内酯环开裂，与亚硫酸的反应只 涉及了上述第二种反应历程；并且反应完全受控于s02气体 的通入速度和量。硫代硫酸钠与稀硫酸反应时，s02产生缓 慢，断马钱子酸与亚硫酸反应完全需经历5 h；硫代硫酸钠 与浓硫酸反应时，s02产生迅速，断马钱子酸与亚硫酸反应 完全仅需要2 mino在断马钱

14、子酸与亚硫酸的反应中，未检测到硫熏金银花 中另外一个主要衍生物4的生成，推测其可能的原因有二： 新鲜的金银花在硫磺熏蒸过程中，复杂的组织环境和丰富 的酶系统使化合物2或3进一步甲酯化产生了化合物4,而该研究采用断马钱 子昔与s02水溶液反应，不能完全反映硫磺熏蒸金银花的复 杂过程；金银花中含具有开链醛基的化合物开链马钱子 昔，它在硫熏过程中与亚硫酸发生加成反应，产生化合物4。新鲜的金银花含水量较大，经过硫磺熏蒸而富含亚硫 酸，其中的主要环烯瞇菇类成分断马钱子酸在酸性环境中不 稳定，与亚硫酸反应生成其相应的衍生物，该研究为揭示上 述硫磺熏蒸机制提供了进一步的实验依据。近年来越来越多的研究表明硫磺

15、熏蒸不仅导致二氧化 硫残留量超标，而且能够改变其中的化学成分及其生物活 性，比如白芍熏蒸导致芍药昔和苯甲酰芍药昔含量降低，生 成其相应的亚硫酸衍生物8-9,生晒参熏蒸导致人参皂昔 含量降低，生成其亚硫酸钠衍生物10,白芷熏蒸导致其中 取代的咲喃香豆素水解成昔元11,菊花熏蒸导致黄酮昔水 解成其相应昔元12等。本研究为开展上述其他中药硫磺熏 蒸导致化学变化的反应机制研究提供了参考。参考文献1 中国药典.一部s 2010：205.2 shang x f, pan h, li m x, et al. lonicerajaponica thunb： ethnopharmacology, phytoch

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