汉黄芩素抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭实验探究

1、汉黄苓素抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭实验探究摘要目的：研究汉黄苓素对乳腺癌细胞 mda-mb-231生长和增殖的影响，同时观察汉黄苓素对 mda-mb-231细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响，进一步探讨 其分子作用机制。方法：mtt法检测汉黄苓素对mda-mb-231 细胞生长的影响；ki-67法检测汉黄苓素对细胞增殖的影响; 划痕实验、黏附试验和侵袭小室法检测对mda-mb-231细胞 迁移和侵袭能力的影响；western blotting检测对增殖和转 移相关蛋白及相关信号通路的影响。结果：汉黄苓素能明显 抑制mda-mb-231细胞生长和增殖；低浓度情况下明显抑制 乳腺癌细胞的迁移、黏附和侵袭

2、能力；汉黄苓素有效抑制 mda-mb-231 细胞 survivin, bel-2, icam-1, mmp-2, mmp-9 蛋白的表达。结论：汉黄苓素明显抑制乳腺癌细胞生长和增 殖，并抑制mda-mb-231细胞迁移、黏附、侵袭，其对 mda-mb-231细胞的侵袭和黏附影响可能与其降低icam-1, mmp-2, mmp-9表达有关。关键词汉黄苓素；凋亡；迁移；侵袭收稿日期2013-09-06基金项目福建省自然科学基金项目(2012d047)；厦门市科技项目(3502z20134043)通信作者黄恺飞，博i, e-mail： hkf5306163. com； 刁勇，博士生导师，e-mai

3、l： diaoyonghqu. edu. cn汉黄苓素是植物黄苓的主要活性成分之一，是一种黄酮 类化合物，主要存在于植物的根和茎中。汉黄苓素具有广泛 的生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、神经保护和抗病毒 等1,尤其在抗肿瘤活性方面，成为国内外研究的一个热 点。目前研究表明，汉黄苓素对多种肿瘤细胞都具有抑制 作用，其机制主要包括：上调p53, bax/bcl-2的比值，下 调survivin诱导细胞凋亡2-4；抑制核因子- k b (nuclear factor-kappa b, nf- k b)信号通路5,阻滞细胞周期由 g1期向g2期过渡6；下调血管内皮生长因子(vascular endot

4、helial growth factor, vegf),同时抑制血管内皮生 长因 子受体-2 ( vascular endothelial growth fac tor receptor-2, vegfr-2)的磷酸化，从而抑制肿瘤血管生成 等7-8 o本课题组同样发现汉黄苓素对肺癌、乳腺癌具有 良好的抑制作用4, 9。虽然汉黄苓素的抗肿瘤活性成为众 多研究人员关注的热点，但是其研究广度与深度尚不足，其 确切机制尚不清楚。本研究观察了汉黄苓素对乳腺癌 mda-mb-231细胞生长、增殖、迁移、侵袭的影响，为汉黄苓 素在抗乳腺癌的临床应用及其作用机制的深入研究提供实 验基础。1材料与方法1. 1

5、细胞株、试剂和仪器 乳腺癌mda-mb-231细胞由本 实验室保存并提供。兔抗人细胞间黏附分子t (intercellular adhesion molecule-1, icamt), mmp-9, mmp-2, survivin, bcl-2多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记 的羊抗兔igg多克隆抗体均为武汉博士德生物工程有限公司 产品；ki-67检测试剂盒购自南京凯基生物公司；汉黄苓素 (wogonin)购自 sigma 公司(纯度98%)o rpmi 1640 培养 液干粉和小牛血清为gibco公司产品；化学发光试剂盒、蛋 白定量试剂盒、纤黏连蛋白(fibrinectin, fn)和层黏连

6、蛋白(laminin, lm) 为sigma公司产品；thincert侵袭小 室为greiner公司产品。酶标仪为美国md公司产品；倒置 相差显微镜为nikon公司产品；垂直电泳槽凝胶和成像仪及 分析系统均为bio-rad公司产品。1.2 mtt法检测汉黄苓素对mda-mb-231细胞活力的影 响mda-mb-231细胞培养于含10%胎牛血清1640培养基中， 将对数生长期的肿瘤细胞消化、计数，9x103个/孔铺于96 孔板，过夜后加入以1640培养液配制的汉黄苓素至终浓度 分别为 10, 20, 40, 80, 160, 320 nmol - l-1,对照组仅 加入相应体积的培养液，每一浓度

7、设6个平行孔，继续培养 44 h,弃上清，每孔加入无血清1640培养液溶解的mtt (50 mg/孔),37 °c, 5%c02细胞培养箱孵育4h,弃上清，以dmso 溶解蓝紫色颗粒，于酶标仪570 nm处测吸光度，再计算细 胞抑制率。1. 3 ki-67流式细胞仪检测法观察对细胞增殖的影响 采 用爬片法收集细胞，即将细胞接种于孔底放置了洁净盖玻片 的6孔培养板中，每孔含1 x105个细胞，置37 °c, 5%c02 饱和湿度的细胞培养箱内培养。待细胞贴壁后加入汉黄苓 素，分别为50, 100, 150 nmol - l-1 3个浓度，药物作用 48 h后收集细胞，0.3

8、ml pbs重悬细胞，慢慢加入0. 7 ml 预冷100%乙醇，4 °c孵育1 h。离心沉淀细胞，加入0.5 ml 2 mol l-1 的 hc1 含 0. 5% triton x-100,室温孵育 30 min。 沉淀细胞并且移去上清，用0. 5 ml 0. 1 mol l-1四硼酸钠 重悬细胞2 min,沉淀细胞。用150 u l pbs/1%bsa洗细胞 1次，50 ul 0.5%聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯 (tween-20) /1%bsa/pbs 重悬细胞，加 1020 n l (1 pg/106 个)ki67 (mab, 1 : 100)在室温下孵育 1 h。沉 淀细胞

9、用150 ul pbs/1% bsa洗1次。沉淀细胞用50 n l 0. 5% tween-20/l%bsa/pbs 重悬，加 5 u l (1 ug/106 个)， 羊抗鼠二抗-fitc,室温下孵育30 min。沉淀细胞转移至facs 管子，流式细胞仪检测。1.4细胞黏附实验分别将fn, lm各2.0 ug铺于96孔板，室温干燥后，用含1%的bsa 培养液1640封闭过夜，pbs洗3次，以含0. 1% bsa的无血 清1640培养液悬浮mda-mb-231细胞，每孔加入8x103个 细胞，加药组同时加入以含0. 1%bsa的无血清1640培养液 配制的汉黄苓素至终浓度10, 20, 30 n

10、mol - l-1, 37 °c, 5% c02细胞培养箱中孵育4 h, pbs轻轻吹打，洗去未黏附 的细胞，弃去残余pbs,每孔加入100 nl无血清1640培养 液溶解mtt （50 mg/孔），于细胞培养箱中继续培养4 h,弃 上清，加入150 ul dmso,室温震荡10 min,充分混匀， 酶标仪测定570 nm处吸光度。细胞黏附率以黏附细胞与总 细胞570 nm的比值来表示。1. 5细胞迁移实验 将mda-mb-231细胞按6x104个/孔 的密度接种到24孔培养板中，培养24 h,待细胞长成均匀 单层后，用无菌的10 ul移液器枪头沿着细胞孔的中轴线 轻轻划过。采用37

11、 £于处理的pbs缓冲液冲洗，除去细胞 残骸，加入含浓度为10, 20, 30 nmol - l-1的汉黄苓素的 培养液，继续培养0.5lh后，以这一时间作为零时间点, 分别在0, 12, 24, 36 h这4个时间点，用倒置光学显微镜 观察细胞迁移情况，并利用目镜刻度尺测量划痕宽度（s）, 每孔测量5处（即两端、中点、左1/4处和右1/4处），求 平均值，每组细胞均设3个平行孔。按照如下公式计算细胞 迁移率（migration rate, mr） = （s零时间点-s对应时间 点）/s零时间点x100%o1.6细胞侵袭实验 取对数生长期的mda-mb-231细胞用 0. 025%e

12、dta/pbs消化并重悬于含0. 1% bsa的无血清rpmi 1640培养基中，调细胞浓度为2. 5x105个/ml,向transwell 小室中加入200 ul含浓度为10, 20, 30 nmol l-1汉黄 苓素的单细胞悬液（即5.0x104个细胞）；24孔细胞培养板 中加入600 ul含10%胎牛血清的1640培养基，37 °c温育 24 ho取出transwell小室，甲醇-冰醋酸（3 : 1）混合液 处理固定10 min,然后用10%姬姆萨染液染色1530 min； 将膜用蒸馆水漂洗干净后，在倒置光学显微镜下（200倍） 随机选取6个视野（上、下、左、右各1个，中央2个

13、）计 数，阳性细胞呈紫色。1. 7 western blotting检测增殖和迁移相关蛋白采用 浓度为50,100,150 nmoll-1的汉黄苓素处理mda-mb-231 细胞24h,以未加药组为对照组，离心收集细胞，提取细胞 总蛋白，12% sds-page分离蛋白（100 v电流）2 h,分离 后的蛋白电转移至硝酸纤维素（nitrocellulose, nc）膜上, 用含10%脱脂奶粉的封闭液封闭后，加入兔抗人survivin, bcl-2, icam-1, mmp-2, mmp-9 多克隆抗体（1 : 200 稀释）, 4 °c反应过夜，用tbst缓冲液漂洗后加入辣根过氧化物

14、酶 标记的羊抗兔igg抗体，室温条件下反应2 h,最后采用化 学发光法显色，其中以-actin作为内对照。目的蛋白相 对表达量二目的蛋白表达灰度/内参蛋白表达灰度x 100%1.8统计学处理采用spss 13. 0统计学软件进行分析。 计量数据以土s表示，数据两两比较采用t检验，多组之间 的比较采用单因素方差分析，以p 2.3汉黄苓素对乳 腺癌细胞 survivin, bel-2, icam-1, mmp-2, mmp-9 蛋白表 达的影响汉黄苓素能导致人乳腺癌细胞mda-mb-231中 survivin, bel-2, icam-1, mmp-2, mmp-9 蛋白表达明显下 调，并随着汉黄

15、苓素的浓度升高而降低，呈一定浓度依赖性。 提示汉黄苓素可能通过抑制survivin表达而抑制细胞增殖。 同时减少icam-1, mmp-2, mmp-9基因表达而抑制乳腺癌细 胞的黏附、转移和侵袭（图6）。3讨论乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的 7%10%,全世界每年新发乳腺癌约150万例，死亡57万例, 而且发病率目前有增高趋势，有可能超过宫颈癌而居女性恶 性肿瘤的首位10,寻找具有低毒、高效的抗乳腺癌药物成 为广大科研人员的重要任务。癌细胞脱离它们本身的细胞群而在别的器官上停留下 来，在其他的部位形成新的肿瘤，这种现象称为癌细胞转移, 肿瘤的转移使得肿瘤通过现有的方法治疗变

16、得更加困难。因 此，调控肿瘤细胞的迁移、转移也是治疗肿瘤的一种有效方 法。icam-1属于免疫球蛋白超家族，是一种重要的表面黏附 分子，它们往往在人体正常组织不表达或很少表达，而在一 些恶性肿瘤中过度表达，因此，在肿瘤细胞的黏附和侵袭转 移过程中其可能具有重要的作用。基质金属蛋白酶（mmps） 是一类能降解胞外基质的膜结合蛋白，在促进癌转移方面起 重要作用。研究表明，在mmps家族中，癌细胞分泌的明胶 酶/四型胶原酶（mmp-2和mmp-9）在癌细胞侵袭和转移方面 是十分重要的，因为肿瘤细胞要实现远端传播，必须穿过血 管壁中富含四型胶原的基质膜。细胞凋亡是受基因控制的， 存活素（survivi

17、n）是一种在人类众多恶性肿瘤组织中广泛 表达而在正常终末分化组织中不表达或低表达的凋亡抑制 蛋白，具有调控细胞凋亡和细胞周期的双重功能，其过度表 达在人多种肿瘤的发生、发展及预后中具有重要作用11。本研究表明，汉黄苓素能明显诱导乳腺癌mda-mb-231 细胞凋亡并抑制其黏附、迁移和侵袭能力，降低乳腺癌细胞 的转移；进一步研究发现其抑制增殖可能与降低survivin 表达有关，其抗肿瘤转移可能是通过抑制i cam-1, mmp-2, mmp-9来实现。汉黄苓素抗肿瘤的分子机制颇为复杂，本研 究将为汉黄苓素的抗肿瘤研究提供部分研究基础，有助于其 进一步的新药开发研究。参考文献1ren xiao-

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24、onin onproliferation and invasion of breast cancer cellshuang kai-fei, zhuang yuan, huang yi-qi, diao yong(1.institute of molecular medicine , huaqiao university, quanzhou 362021, china；2. drug research and development center, xiamen medicine research institute， xiamen 361003, china)abstract objecti

25、ve: to study the inhibitory effect of wogonin on the growth and proliferation of breast cancer cells mda-mb-23, and observe its effect on the adhesion, migration and invasion of mda-mb-23 cells , in order to further study its molecular mechanism. method： mtt assay was used to detect the effec t of wogonin on mda-mb-23 cell grow th. ki67 assay was adopted to test the effect of wogonin on cell proliferation. scratch test , adherence test and invasion chamber assay were taken to detect