检测细胞中1―磷酸鞘氨醇含量LC―MS-MS研究方法建立

1、检测细胞中1 一磷酸鞘氨醇含量lc-ms/ms研究方法建立摘要目的建立并确证可以检测1-磷酸鞘氨醇(s1p)快速、灵敏、特异的lc-ms/ms定量分析方法。方 法采用c17-s1p作为内参，甲醇一步法进行蛋白沉淀，随 后进行正相电喷雾离子化lc-ms/ms分析。流动相为甲醇 -0.1%甲酸水(95 ： 5, v/v),流速0. 2ml/min,每个样品的 分析时间为4 min。细胞经tnf- a处理后s1p含量显著增加; 而经dms处理后s1p含量显著下降。结果s1p的标准曲线 线性范围为0. 110ng/ml。相关系数r2均大于0.989。结 论 该方法可以快速，灵敏，特异性地同时检测生物样

2、品中 s1p的含量。关键词含量测定；1-磷酸鞘氨醇；液质联用中图分类号r743. 3 文献标识码a 文章编号 2095-0616 (2013) 09-09-03鞘磷脂不仅是细胞膜的主要成分，也可作为信号分子调 控多种细胞进程，包括细胞增殖，分化，存活，死亡以及一 些细胞的炎症反应1-2 o几种磷脂类代谢物，特别是鞘氨 醇(sph)和1-磷酸鞘氨醇(s1p)被认为是具有显著生物活 性的关键分子，控制着细胞生存和死亡。s1p可以被s1p磷 酸酶去磷酸化为spho sph作为负性调节因子，抑制细胞增 殖和促进凋亡。相反，s1p作为sph的磷酸化产物，参与了 促进细胞增殖和抑制凋亡过程3。目前已有一些

3、方法用于 测定生物样品中低丰度的s1p含量。这些方法包括放射性同 位素掺入酶促反应实验4,放射性受体结合实验5, hplc 柱前衍生化6-7,质谱8-9以及lc-ms/ms等。在本研究中，我们建立了一种快速，简便，灵敏的lc-ms/ms分析方法。本方法成功地测定了 hek293细胞中 s1p的含量。1仪器与试药finnigan tsq quantum 三重四极杆质谱仪(thermo electron, san jose, ca, usa),色谱分析柱为 luna-rpc18 色谱柱 (150 mm lx2 mm i. d. , 5 y m particle size and 100 ? por

4、e size)；外加 c18 保护预柱(4. 0 mm l x2. 0 mm i. d. ) (phenomenex, torrance, ca, usa)o derythro-1- 磷酸鞘氨醇(sip), c17-d-erythro-l-磷酸鞘氨醇(c17-s1p) 购自 avanti polar lipids (美国)。sip 和 c17-s1p 的贮存 液dms0/浓盐酸(100 : 2, v/v)配制，浓度均为100 u g/mlo 用甲醇配制并于-2(rc保存。实验时贮存液用甲醇进一步稀 释成工作液。hplc级甲醇和甲酸购自tedia公司(美国)。 其他所有有机溶剂和化学品均为分析纯

5、级。tnf-a购自 biosource(美国)；二甲基鞘氨醇(dms)购自 biomol research laboratories公司(美国)；超纯水由milli-q plus水纯化 设备提供(美国)。2方法和结果2. 1色谱条件溶剂及样品经finnigan自动进样器和质谱泵进行分离。 柱温为25°co流动相为甲醇-水(95 : 5, v/v)(水中含0. 1% 甲酸)；流速为0. 2 ml/mino每个样品的分析时间为4 min。 流动相调控色谱行为和恰当的离子化。为了摸索最优流动相 条件，我们研究了不同比例的甲醇，乙睛和水对实验的影响。 乙睛能够降低样品的分析时间，每个样品可以

6、在2 min内分 析完毕，但峰型比较宽，有一定的脱尾。而增加液相中甲醇 的比例可以改善灵敏度和峰型，尽管分析时间长了一些。此 外，加入少量甲酸可以提高灵敏度和改善峰型。最终，本实 验摸索的最优流动相组成为：95%甲醇和5%甲酸水(甲酸水 中含有0. 1%的甲酸)。在该流动相条件下，每个样品在4min 内分析完成。2.2质谱条件2. 3细胞培养人胚胎肾细胞293 (hek293)培养在含10% (v/v)胎牛 血清，2 mm谷氨酰胺，0.2% (w/v)碳酸氢钠，100 u/ml青 霉素和100 ug/ml链霉素的dmem培养基中。细胞于37°c, 5% c02培养箱中培养，细胞长至汇

7、合状时，采用0.25%胰酶 进行消化传代。2. 4样品收集和制备2. 5制备标准品2. 6方法学考察3讨论s1p作为磷脂类小分子化合物，其在生物体内的含量较 低。最早人们采用放射自显影技术进行s1p含量测定。该实 验采用放射性标记的底物v-32p1atp进行体外酶促反应， 随后采用有机溶剂抽提和tlc分离，再用放射自显影方法捕 捉产物信号，最后采用液闪仪或磷屛扫描进行定量分析4。 另一种分析方法涉及到放射性受体竞争性结合实验，该实验 通过3hs1p与未标记的s1p竞争性与s1p1受体结合5。 以上这些方法不仅费力耗时，而且难以区分结构相似的化合 物，例如s1p和dhsipo因此，随后人们使用h

8、plc作为一种 替代方法来定量分析s1p以及相关化合物。使用hplc时， sph直接转换成其荧光衍生物，而s1p则被碱性磷酸酶去磷 酸化转变成sph,再进行柱前衍生化。随后，荧光衍生物经 hplc分离后被荧光分光光度计检测5-6, 12-17。尽管hplc 方法避免使用到放射性试剂，但由于其样品提取步骤繁琐， 且需要柱前衍生化，不适合大样本分析。质谱技术是一类分析鞘磷脂代谢产物非常灵敏的分析 方法，特别适合生物样本中低丰度s1p的定量分析18。质 谱技术的成功应用依赖于目标物质能否气化，并且他们产生 的离子可以被特异性地检测出来。由于鞘磷脂类分子较容易 离子化，而且所产生的碎片离子因其有特异的

9、官能团和骨架 结构而较容易鉴定区分19,因此磷脂类分子特别适合质谱 分析。近来有通过将样品提取液直接注入质谱仪中进行分析 的方法，该类方法较之hplc更为简便和灵敏8。不过，由 于缺少色谱分离环节，该种方法需要多步提取来尽可能降低 诸如等离子干扰以及基质效应的影响，这些因素反过来又使 得这种方法存在费力耗时的缺点，限制其广泛使用。lc-ms/ms技术是hplc和ms技术的完美结合，具有更高的灵 敏度，选择性，特异性以及高通量等特点，特别适合大样本 分析。本实验建立并验证了一种运用lc-ms/ms技术测量s1p含量的定量分析方法。该方法采用甲醇一步沉淀法 提取，无需样品气化，采用非放射性标记的内

10、标(c17-s1p) 来检测生物样品中s1p的含量。流动相组分为甲醇和0.1% 甲酸水(95 : 5, v/v)o每个样品的分析时间控制在4 min 内，可以满足大样本分析的要求。本方法将在研究s1p的生 物学效应以及相应靶标药物的筛选方面得到广泛应用。参考文献 huwiler a, zangemeis ter-w it tke u. targe ting the conversion of ceramide to sphingosine 1-phosphate as a novel strategy for cancer therapyjcrit rev oncol hematol, 200

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