免疫实验技术

1、流式细胞技术1.流式细胞技术的特点及影响因素：特点：“六高一低” 高精度、高速度、高灵敏度、高纯度、高效率、高科技含量 低分辨率影响因素：“三稳定一确保” 细胞荧光染色的实验条件要稳定 正交光电测量系统要稳定 鞘液流速系统要稳定 确保细胞悬液分散均匀，不得混有过量的杂质 2.流式细胞分析技术在细胞生物学中的应用：1.细胞表面分子分析（淋巴细胞分型/白细胞分型）2.DNA含量、细胞周期/细胞凋亡的检测与分析3.血小板及其活化分析4.胞内蛋白质分析（细胞因子/转染率检测）5.可溶性蛋白质检测（CBA法）6.细胞功能分析7.其他（牛奶微生物检测）流式细胞仪包括:光学系统,液流系统,数据处理系统,检测

2、系统原理:经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当细胞或微球经过焦点时,发出一束散射光和(或)荧光，并经过滤光镜系统收集到达一个光电检测器,光电检测器把光信号定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储数据。数据以直方图，二维散点图，等高线图，灰度图以及三维图等多种形式显示,分析。流式细胞步骤：1、 每组取两个EP管，分别标记为ISO（对照组）和TEST（实验组），每管加入100uL全血；2、 在TEST管中加入5uL的实验抗体（CD4-FITC,CD8-PE），ISO管中加入5uL的同型对照抗体，室温避光20min；3、 加入1mL红细胞裂解液，混匀静

3、置5min，再次混匀后静置3min，200g离心5min，去上清，每管中加入PBS洗液1mL，混匀后离心5min；4、 重复洗涤一次，每管加入200uL洗液重悬，转入流式专用测试管。单细胞悬液的制备技术定量细胞学荧光染色技术定量细胞学荧光染色的质量容易受到多种因素的影响，从而带来分析结果的误差，最主要的影响因素有：温度效应、pH效应、浓度效应、溶剂效应派若宁及其染色技术ELISA基本原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体

4、按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA常用的四种方法1直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面；加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；加底物。底物的降解量抗原量。  2间接法测定抗体将抗原吸附于固相载体表面；加抗体, 形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加

5、底物。 测定底物的降解量抗体量。 3双抗体夹心法测定抗原将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;加酶标抗体（第二种动物抗体的抗体）; 加底物。底物的降解量抗原量。 4. 竞争法测定抗原将抗体吸附在固相载体表面;（1） 加入酶标抗原；（2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。 5捕获包被法测抗体：目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被

6、固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色 6.ABS-ELISA法ELISA的应用1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。ELISA的优点具有灵敏度高,特异性强,操作简单,观察结果容易,便于大规模检测的特点.既可定性,也能定量,还可以定位,为一种颇为理想的微量测定技术,已经广泛用于各种抗原抗体的检测和研究.淋巴细胞转化实验原理：淋巴细胞在体外培养时，受到抗原的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖

7、。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。PBMC分离基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.092，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重为1.0751.090；Ficoll比重为1.077±0.001。将血液标本置于分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中。细胞浓度(个/ml)=(4个大方格内细胞总数/4)×104×稀释倍数细胞总数(个)=细胞浓度×细胞悬液体积(ml)淋巴细胞转化实验流程-注意事项：1.所有过程均需注意无菌操作，动作尽量快且轻柔2.

8、加入稀释血至分离液上层时请注意勿搅乱分层液液面。3.密度梯度离心过程中不能用离心机“刹车”档，以保持分层界面清晰4.细胞计数前一定要将离心后细胞重悬成单个细胞悬液5.加入MTT并继续培养后一定要小心轻放细胞培养板，小心吸去上清以免吸去细胞6.加入DMSO后要混匀让甲臜颗粒充分溶解。蛋白质免疫印记基本原理：在电场作用下将电泳分离的蛋白由凝胶转移至固相载体，用识别此多肽的抗体进行检测步骤:蛋白样品的制备-制胶(先制分离胶后制积层胶)-上样-电泳-电转移-抗体杂交及显示应用：1.检测样品中的蛋白。基于：被测蛋白与抗体的特异性结合以及蛋白质的相对分子量2.未知抗原与已知蛋白的关系3.评价新抗体的特性4

9、.蛋白质酪氨酸残基是否发生磷酸化5.不能用于检测蛋白质的生化特性、化学修饰或半寿期SDS的作用：1.SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.2.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.3.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位), SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小有关样品的制备 样品缓冲液的配制1.SDS:断裂分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构.2.巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT):使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂.3.甘油:比重大4.溴酚蓝:指示剂5.缓冲液转移方向阴极-滤纸(2层)凝胶NC膜滤纸(2层)-正极内参照：评价各个上样孔内胞内蛋白的总量是否基本一致通常使用一些看家蛋白，比如-actin、GAPDH等等这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，而且很少受外界因素影响而发生变化，所以用他们来作为加样量的对照。目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格