SDS-PAGE电泳注意事项

1、SDS是阴离子去污剂，作为 变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去 折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。强还原剂如 巯基乙醇 ，二硫苏糖醇 能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入 还原剂和 SDS 后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。浓缩胶的作用 是有堆积作用， 凝胶浓度较小， 孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过 大孔径凝胶的迁移作用而被 浓缩至一个狭窄的区带。聚丙烯酰胺凝胶由 单体丙烯酰胺 和甲叉双丙烯酰胺 聚合而成，催化聚合的常用方法有

2、两种： 化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED） 为加速剂。不连续体系由电极缓冲液、 浓缩胶及分离胶所组成。 浓缩胶是由AP催化聚合而成的 大孔胶， 凝胶缓冲液为的Tris-HCI。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为 Tris-HCI。 电极缓冲液是 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体 系形成了 凝胶孔径、 pH 值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于 提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在 SDS电 泳上应只有一条带， 但如果蛋白质是由不同

3、的亚基组成的， 它在电泳中可能会形成分别 对应 于各个亚基的几条带。注意问题1. 样品处理上样缓冲液的作用：形成SDS蛋白复合物，使其带负电；SDS和巯基乙醇 使蛋白质解离，综上两点为了在电泳中，只根据分子量来分离。SDS作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠， 还有助溶剂的作用 。2. SDS-PAGEt泳凝胶中各主要成分的作用1）浓缩与分离胶凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。3. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。 忌即配即用或 4 度冰箱放置 ，前者易导致凝固不充分，后者可导

4、致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。4. .“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因主要是由于凝胶的 中间部分凝固不均匀所致 ，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其 充分凝固 再作后续实验。5. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中， 一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。6. 带出现拖尾现象主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法： 加样前离心； 选择适当的样品缓冲液， 加适量样品促溶剂； 电泳缓冲液时间过长， 重新配制；降低凝胶浓度。7. 带出现纹理现象主要是样品不

5、溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。8. 溴酚蓝不能起到指示作用实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底， 但蛋白质却还未跑下来的现象。 主要与缓冲液和分离胶 的浓度有关。处理办法：更换正确 pH值的Buffer ；降低分离胶的浓度。9. 电泳的条带很粗电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH 正确（）；适当降低电压；10. 电泳电压很高而电流却很低呢比如电压 50v 以上，可电流却在 5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成 通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶

6、用的 橡胶皮）。11. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳影响一般对电泳不会有太大的影响。 前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致； 后者是由于 在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。12. 凝胶时间不对，或慢或快通常胶在 30MIN-1H 内凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED，APS 剂量不够或者失效。 APS 应该现配现用， TEMED 不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快，可能是 APS 和 TEMED 用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。13. 电泳时间比正常要长可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH 选择错误，即缓冲系统地 PH 和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。14. 分离胶加上后为什么要 立即 加水加入分离胶后，立即覆一层双蒸水， 一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压 平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。注意：SDS-PAGE电泳关键在于胶是否制得均匀平整，当然这跟灌胶用的模具和方法有一定 关系。加入TEMED和过硫酸铵后丙烯酰胺开始聚合，但是过硫酸铵易被氧化，所以操作要 迅速， 而且最后要液封， 保证模具内不漏气才能使胶聚合的很好。 同时不要把制胶用的玻璃 板中间压太紧， 这样会使