马鹿茸水溶性总蛋白提取工艺研究

1、马鹿茸水溶性总蛋白提取工艺研究(泸州医学院附属医院中药房四川泸州646000)【摘要】目的：优选鹿茸水溶性蛋白的最佳提取工艺。方法：以马旎茸为原料， 采用组织匀浆结合浸提的方法提取可溶性蛋白，以鹿茸可溶性蛋白得率和含量为 评价指标，通过单因素实验研究匀浆方法、匀浆次数、提取溶液浓度和ph对旎 茸可溶性蛋白得率的影响，优化提取工艺。结果：旎茸可溶性蛋白的最佳提取工 艺为,以ph为7, 50mmol•l-l的trishci缓冲溶液为提取溶剂，采用电动 匀浆机，匀浆次数为3次。结论：优化得到的提取工艺稳定、可行，可为进一步 研究鹿茸蛋白的药理药效提供参考。【关键词】鹿茸；水溶性蛋白

2、；提取工艺【中图分类号】r285.5【文献标识码】a【文章编号】2095-1752 (2016) 02-0367-02optimization of extractio n tech no logy of soluble protei ns from velvet an tier of cervus elaphus linnaeus zhou jie.pharmacy of chinese medicine affiliated hospital of luzhou medical college, luzhou 646000, sichuan chinaabstract 】objective

3、 to optimize the appropriate extract! ng tech no logy for soluble protei ns from velvet an tier. methods extracted the soluble protei ns with homogenate method, studied the effect of homogenate method, homogenate times, con centrati on and ph of extraction solve nt, using soluble protei ns extractio

4、n rates and content as the in dices. results: the optimal extract! on technology for the soluble protei ns was as follows: electric homoge nate, the extractio n solve nt of 50 mmol•l-l, ph of 7.the extraction rate of he soluble proteins from velvet antler was and the content of the soluble

5、proteins was .conclusion the optimal extraction tech no logy is stable and feasible, and can provide ref ere nee for further study on velvet an tier.【key words velvet an tier; soluble protei ns; extractio n tech no logy鹿茸为鹿科动物梅花鹿（cervus nippon tennminck ）或马鹿（cervus elaphus linnaeus）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具有壮

6、肾阳，益精血，强筋骨 等作用1。鹿茸中含多种活性物质，其中鹿茸蛋白占鹿茸总质量的52%以上2, 现代研究表明，鹿茸蛋白能在多方面调节人体生理功能，对内分泌、免疫、血液 系统等均有影响3-4o目前对于该成分的提取工艺研究方面，大多采取简单的静 置和搅拌方式5-7,张梦莹等8采用碳酸盐缓冲溶液结合超声波技术提取， tris-hci缓冲溶液结合组织破碎的提取方法还未见报道。本研究将tris-hci缓冲溶 液浸提和组织破碎的提取方法相结合，并优选出较优提取工艺参数，为进一步开 发和利用鹿茸这一宝贵资源提供科学依据。1 .仪器与试药1.1仪器tu-19系列紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）；ne

7、ofuge23r 高速冷冻离心机（heal force公司）；ult1386-3-v30超低温冰箱（日本三洋电器 公司）；phs-3c型酸度计（上海伟业公司）；电动匀浆器（美的公司）；fsh-2a可 调高速匀浆机（江苏金坛市医疗仪器厂）。1.2实验材料内蒙古赤峰巴林左旗雄性马鹿鹿茸；采茸方式为全身麻醉消毒锯茸留血 密封后冷藏运输，2小时内放置80°c冷冻保存。1.3试药与试液标准牛血清白蛋白（bsa）（北京拜耳迪公司）；考马斯亮蓝试剂（g-250） （北京拜耳迪公司），并参照文献方法配制成溶液8；三梵甲基氨基甲烷（tris, sigma公司）；其他试剂均为分析纯。2 .方法与结果2.

8、1蛋白质含量测定方法学的建立2.1.1对照品溶液制备 精密称取牛血清白蛋白l.omg,用蒸惚水溶解并 定容至10ml,配成浓度为o.lmg/ml的牛血清蛋白标准溶液,保存在4°c冰箱中， 待用。2丄2样品的制备 称取鹿茸样品10g,解冻，切薄片，用4°c的蒸憎水冲洗；4°c 下，用50ml的tris-hci缓冲液(50mmol/l, ph值为7)提取24h；将鹿茸放入 匀浆机中匀浆3次，每次10s,每次暂停3s；将渗出液合并残渣在4°c下浸提24h； 离心20min (10000r/min, 4°c ),取上清,得到待测样品。2.1.3标准曲线

9、的制定 分别精密吸取对照品溶液0、100、200、400、 600、800、1000μl,于10ml刻度试管中，加入5 ml考马斯蓝g-250显色剂， 混匀，放置10min,冷却至室温，并同吋制备空白溶液，于595nm处测其吸光 度，以对照品溶液的含量为横坐标，以吸收度为纵坐标，绘制标准曲线，其回归 方程为：y=0.005x+0.046,相关系数r=0.9991,线性范围为10ugloougo2.1.4精密度考察 精密吸取对照品溶液800 μl,按2.1.3项的方法 测定，在595nm波长下，连续测定5次，其rsd值为0.6%,表明仪器精密度符 合方法学考察要求。2

10、.1.5重现性考察 分别称取相同质量的5份样品，按2.1.2项下制备样 品，按2.1.3项下的方法测定，计算rsd值为2.8%,本方法重现性符合方法学考 察要求。2.1.6显色稳定性考察 称取1份样品，按2.1.2项下制备样品，按2.1.3 项下的方法测定，在595nm波长处，分别于5、15、25、35、45、55 min吋， 测定吸收值，计算rsd值为1.4%,表明供试品在显色55 min内保持稳定。2.1.7加样冋收率实验 精密移取已制备的供试品溶液5份，每份0.5ml, 分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml的蛋白质标准溶液，按2.1.3项下的方法测 定，样品平均冋收率为83

11、.3%, rsd为2.1%。2.2匀浆方法对马鹿茸总蛋白提取率的影响匀浆是破碎机体软组织最常用的方法之一，它的工作原理是通过固体剪 切力破碎组织和细胞，释放蛋白进入溶液。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解 的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速、风险小的组织破碎方法。本实验比较了 fsh-2a可调高速匀浆机和电动匀浆器两者在鹿茸蛋白提取应用中的优劣，结果 见表表明fsh-2a可调匀浆机处理鹿茸样品的蛋白提取率更高，但每次处理 量少，需要吋间更长。2.3匀浆次数对马鹿茸总蛋白提取率的影响考察匀浆次数分别为1、2、3、4、5次对马鹿茸总蛋白提取率的影响, 以匀浆次数为横坐标，以蛋白提取率为纵坐标，结果见

12、图1。随着匀浆次数的增 加，总蛋白提取率增高，匀浆次数超过3吋，蛋白提取率增高的趋势放缓，为了 减少蛋白质变性及提取时间，确定匀浆次数为3次。3.讨论本实验考察了 fsh2a可调高速匀浆机与电动匀浆机对鹿茸水溶性总蛋 白提取率的影响，从实验结果看出fsh-2a可调高速匀浆机蛋白得率较高，但每 次处理量少，适合实验室研究，在大工业大生产中，电动匀浆机更方便、处理样 品更多、更节约时间。本实验对匀浆次数、提取液离子强度和ph值进行了单因素考察，确定 了马鹿茸水溶性蛋白的最佳提取条件为：电动匀浆机匀浆3次，tris-hci浓度为 50 mmol•l-l, ph 值为 7。由于鹿茸不

13、同分叉、不同部位所含的蛋白成分和含量可能不同，为了减 少由此带来的干扰，本实验都选取具有两个分枝的马鹿茸，从分枝顶端开始截取 10cm进行切片、混匀，称取10g进行样品制备。本实验对匀浆方法、匀浆次数、缓冲液浓度和ph值进行了单因素考察， 但为了进一步优化工艺，还应采取单因素或正交试验法对浸提时间、料液比等条 件进行全面的考察。【参考文献】国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版：1部m.北京：中国医药科 技出版社，2010： 303.佟鑫，刘玉侠，吴荻等鹿茸多肽组分药理作用的研究进展j中国医药技术经 济与管理，2009, 3 (4)： 60-62.3 刘瑜，王振宇，周丽萍鹿茸提取物对糖

14、尿病小鼠血糖及衰老的影响j东北林 业大学学报，2010, 38 (5)： 97-98, 113.4 zhao l, luo yc, wang ct, et al. antioxidant activity of protein hydrolysates extract of velvet antle(cervus elaphus)as molecular weight and enzymesj. natural product communications, 2011 (6)： 1683-1688.岳喜庆，徐明，王澜儒响应曲面法优化鹿茸蛋白提取条件j.食品研究与开发， 2011, 32 (9) :59-62.