第六免疫比浊分析

1、人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 第六章第六章免疫比浊分析免疫比浊分析李士军李士军 教授教授大连医科大学附属第一医院检验科大连医科大学附属第一医院检验科人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 目录目录 免疫比浊技术原理免疫比浊技术原理 1自动化免疫比浊分析自动化免疫比浊分析 2返回总目录返回总目录小结小结 3人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 第一节第一节 免疫比浊技术原理免疫比浊技术原理免疫比浊技术分类：免疫比浊技术分类：透射免疫比浊法透射免疫比浊法（turbidimetric immunoassa

2、y）散射免疫比浊法散射免疫比浊法（nephelometry immunoassay）速率散射比浊法速率散射比浊法终点散射比浊法终点散射比浊法人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 4一、透射免疫比浊法一、透射免疫比浊法 当一定波长的光通过抗原抗体反应形成当一定波长的光通过抗原抗体反应形成的免疫复合物时会因为反射和吸收而减弱，的免疫复合物时会因为反射和吸收而减弱，一定范围内，透射光被吸收的量与复合物的一定范围内，透射光被吸收的量与复合物的量呈量呈正相关正相关关系，而复合物的量与抗原抗体关系，而复合物的量与抗原抗体量为一定的函数关系。量为一定的函数关系。（一）基本原理（

3、一）基本原理人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 在抗原或抗体量一定的条件下，可以利用比在抗原或抗体量一定的条件下，可以利用比浊仪在光源的光路方向上测定透射光强度与浊仪在光源的光路方向上测定透射光强度与入射光强度的比值或吸光度，来判断待测抗入射光强度的比值或吸光度，来判断待测抗原的量，这种方法称为原的量，这种方法称为透射比浊法透射比浊法 。人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 透射免疫比浊法光路图透射免疫比浊法光路图人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 待测的抗原抗体复合物分子量足够大。待测的抗原抗体复合

4、物分子量足够大。 抗原抗体复合物数量足够多。抗原抗体复合物数量足够多。 具有充分的反应时间。具有充分的反应时间。 高亲和力的抗体，并保证抗体过量。高亲和力的抗体，并保证抗体过量。（二）技术要求（二）技术要求人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 透射免疫比浊法的灵敏度是单向琼脂扩散透射免疫比浊法的灵敏度是单向琼脂扩散方法的方法的5 51010倍，但其与标记免疫分析技术倍，但其与标记免疫分析技术相比还不够高。因此，透射比浊类的自动分相比还不够高。因此，透射比浊类的自动分析仪用于免疫测定已趋减少，该测定原理析仪用于免疫测定已趋减少，该测定原理主主要用于生化分析仪。要用于

5、生化分析仪。（三）方法学评价（三）方法学评价人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 抗原抗体反应曲线抗原抗体反应曲线人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 10二、二、散射免疫比浊法散射免疫比浊法散射比浊法散射比浊法是指一定波长的光沿水平轴照射，是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到其中的抗原抗体复合物，光通过溶液时遇到其中的抗原抗体复合物，光线被粒子颗粒折射而发生偏转，产线被粒子颗粒折射而发生偏转，产 生散射生散射光。光。（一）基本原理（一）基本原理人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 其中光线偏转的

6、角度与发射光的波长和抗其中光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物的大小和多少密切相关。散射光原抗体复合物的大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成的强度与复合物的含量成正比正比，即待测的抗原，即待测的抗原越多，形成的复合物越多，散射光就越强。越多，形成的复合物越多，散射光就越强。人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 透射浊度法和散射浊度法的光路透射浊度法和散射浊度法的光路人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 应选择应选择适当适当的光源强度、反应时间、测量的光源强度、反应时间、测量角度及光源的波长。另外，要注意保证抗角度及

7、光源的波长。另外，要注意保证抗原浓度合适。此外，还要选择适宜的离子原浓度合适。此外，还要选择适宜的离子强度、强度、pHpH值等。值等。（二）技术要求（二）技术要求人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 散射免疫比浊法散射免疫比浊法是当今免疫化学分析中比较是当今免疫化学分析中比较有优势的方法。可以实现自动化管理，但用于免有优势的方法。可以实现自动化管理，但用于免疫沉淀反应有很多缺陷，如因为是一次性测定光疫沉淀反应有很多缺陷，如因为是一次性测定光吸收值，没有考虑单个待测样本的散射效果，可吸收值，没有考虑单个待测样本的散射效果，可能使测定结果不准确。能使测定结果不准确。（

8、三）方法学评价（三）方法学评价人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 测定的时间依然较长，且随时间延长，抗测定的时间依然较长，且随时间延长，抗原抗体复合物有重新结合的趋势，可影响散射原抗体复合物有重新结合的趋势，可影响散射值的变化及存在反应本底，在微量测定时，值的变化及存在反应本底，在微量测定时，本本底的干扰底的干扰是影响测定准确性的重要因素。是影响测定准确性的重要因素。人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 16三、三、速率免疫比浊法速率免疫比浊法该法是抗原抗体结合反应的一种该法是抗原抗体结合反应的一种动态测定动态测定方法。方法。将抗原

9、抗体的沉淀反应与散射比浊分析相结合，将抗原抗体的沉淀反应与散射比浊分析相结合，对单位时间内抗原和抗体结合形成复合物的速对单位时间内抗原和抗体结合形成复合物的速度进行动力学测定即为度进行动力学测定即为速率免疫比浊法速率免疫比浊法。（一）基本原理（一）基本原理人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 当抗体的浓度固定于一定范围时，速度峰当抗体的浓度固定于一定范围时，速度峰值的高低与抗原的含量成值的高低与抗原的含量成正比正比，随着时间的延，随着时间的延长，免疫复合物的量逐渐增多，抗原抗体结合长，免疫复合物的量逐渐增多，抗原抗体结合速度的峰值在一定的时间出现。通过微机处理速度

10、的峰值在一定的时间出现。通过微机处理即可得到待测蛋白成份的含量。即可得到待测蛋白成份的含量。人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 累计时间复合物产生总量产生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500512359080706055453020 抗原抗体复合物形成时间与速率的关系抗原抗体复合物形成时间与速率的关系人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 速率散射比浊法速率散射比浊法峰值出现的时间峰值出现的时间与抗体浓与抗体浓度及纯度直接相关，需选用抗体纯度及亲和力度及纯度直

11、接相关，需选用抗体纯度及亲和力交高的试剂。此外，要保证待测样本血清的性交高的试剂。此外，要保证待测样本血清的性状符合要求，如严重脂血等即为不合格样本。状符合要求，如严重脂血等即为不合格样本。（二）技术要求（二）技术要求人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 该法具有快速、敏感度及精密度高的特该法具有快速、敏感度及精密度高的特点，其最大优点在于点，其最大优点在于快速快速，检测不必等到，检测不必等到抗原抗体达到平衡，大大节省反应时间，抗原抗体达到平衡，大大节省反应时间，每小时可检测标本数十份；敏感度高，最每小时可检测标本数十份；敏感度高，最小检出量达微克小检出量达微克/

12、 /升水平。升水平。（三）方法学评价（三）方法学评价人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 21四、免疫胶乳比浊法四、免疫胶乳比浊法将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，制成致敏的胶乳颗粒，当遇到相应抗原时，上，制成致敏的胶乳颗粒，当遇到相应抗原时，发生交联反应，形成抗原抗体复合物，胶乳颗发生交联反应，形成抗原抗体复合物，胶乳颗粒发生凝集。粒发生凝集。（一）基本原理（一）基本原理人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 单个胶乳颗粒在入射光波长之内并不阻单个胶乳颗粒在入射光波长之内并不阻碍光线透

13、过，两个及其两个以上胶乳颗粒凝碍光线透过，两个及其两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过的光减少，其减少的程度与胶聚时则使透过的光减少，其减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，即与待测抗原量乳颗粒凝聚的程度呈正比，即与待测抗原量呈正比，由此可检测样本中的特定抗原含量。呈正比，由此可检测样本中的特定抗原含量。人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 胶乳颗粒的胶乳颗粒的均一性均一性将直接影响光散射作用，将直接影响光散射作用，影响检测结果，因此需要选择均匀一致的影响检测结果，因此需要选择均匀一致的胶乳颗粒。此外，试剂需要加保护剂以提胶乳颗粒。此外，试剂需要加保护剂以提高其稳定性，

14、所用器皿要洁净，避免杂质高其稳定性，所用器皿要洁净，避免杂质微粒的干扰。微粒的干扰。（二）技术要求（二）技术要求人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 该法敏感度高，试剂稳定，个体免疫复该法敏感度高，试剂稳定，个体免疫复合物对结果影响也小，因此结果稳定、可合物对结果影响也小，因此结果稳定、可靠，特异性好，精确度高，且不需要特殊靠，特异性好，精确度高，且不需要特殊的仪器设备，一般分光光度计、自动化生的仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。化分析仪或散射比浊仪均可使用。返回章目录返回章目录（三）方法学评价（三）方法学评价人民卫生出版社人民卫生出

15、版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 （一）（一）BNBN特种蛋白分析测定系统特种蛋白分析测定系统该系统的测定方法是透射免疫比浊法的一种该系统的测定方法是透射免疫比浊法的一种改良。以发光二极管作为光源，检测前向角改良。以发光二极管作为光源，检测前向角13132424度的散射光，然后利用硅化光电二极度的散射光，然后利用硅化光电二极管接收散射光信号，经过微电脑处理，与标管接收散射光信号，经过微电脑处理，与标准曲线进行比较，最后转换成待检物质的浓准曲线进行比较，最后转换成待检物质的浓度。度。第二节第二节 自动化免疫比浊分析自动化免疫比浊分析一、主流免疫比浊设备概况一、主流免疫比浊设备概况1.测

16、定原理测定原理人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 系统由分析仪、计算机、条码读取器、打系统由分析仪、计算机、条码读取器、打印机四部分组成，其中印机四部分组成，其中分析仪分析仪是主要组成部分，是主要组成部分，包括散射测浊仪、自动加样系统、运输装置和包括散射测浊仪、自动加样系统、运输装置和比色杯装置。比色杯装置。 2.仪器基本组成仪器基本组成人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 BN100BN100、BNBN特种蛋白分析分析系统特种蛋白分析分析系统人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 本系统属于速率散射比浊

17、分析法，在抗体过量的本系统属于速率散射比浊分析法，在抗体过量的前提下，光束通过抗原抗体复合物时所产生的散前提下，光束通过抗原抗体复合物时所产生的散射光速率变化大小与抗原浓度成正比。速率的峰射光速率变化大小与抗原浓度成正比。速率的峰值通过电脑处理系统转换成待测抗原的浓度。值通过电脑处理系统转换成待测抗原的浓度。1.测定原理测定原理（二）（二）ARRAYARRAY分析系统分析系统人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 ARRAY ARRAY系统由分析仪、电脑处理系统、打印系统由分析仪、电脑处理系统、打印机构成，其主要构成部分为分析仪，由加液机构成，其主要构成部分为分析仪

18、，由加液系统、散射测浊仪、系统、散射测浊仪、4040孔样本转盘、孔样本转盘、2020孔试孔试剂转盘、软盘驱动器等组成。剂转盘、软盘驱动器等组成。2.仪器基本组成仪器基本组成人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 Array360Array360、IMMAGEIMMAGE特种蛋白分析分析系统特种蛋白分析分析系统人民卫生出版社人民卫生出版社第六章第六章 免疫比浊分析免疫比浊分析 二、免疫比浊分析的主要影响因素二、免疫比浊分析的主要影响因素1 1抗原抗体比例抗原抗体比例 抗原抗体比例要适当。抗原抗体比例要适当。2 2抗体的纯度与效价抗体的纯度与效价 诊断试剂应尽可能诊断试剂应尽可能选择高纯度与高效价的抗体。选择高纯度与高效价的抗体。3 3免疫复合物的大小及稳定性免疫复合物的大小及稳定性 溶液中免溶液中免疫复合物颗粒的分散度尽可能相同，颗粒应疫复合物颗粒的分散度尽可能相同，颗粒应该不容