当归多糖联合阿糖胞苷对移植性人白血病小鼠模型肝脏作用机制

1、当归多糖联合阿糖胞昔对移植性人白血病小鼠模型肝脏作用机制摘要白血病是造血系统的恶性肿瘤，白血病细胞 极易进入血液并浸润、损伤肝脏。本室既往研究表明，当归 多糖(aps)能抑制白血病细胞的增殖和分化，但治疗白血 病时对肝脏的影响未见报道。本研究通过尾静脉移植k562 细胞建立人白血病nod/scid小鼠模型，通过腹腔注射aps、 阿糖胞昔(ara-c)以及两者联合(aps+ara-c)治疗白血病 小鼠，研究对肝脏的影响及其机制。结果表明，与白血病小 鼠对照组相比，aps或ara-c治疗后，外周血白细胞数显著 降低；肝功能损伤减轻：丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬 氨酸氨基转移酶(ast)活性与

2、总胆红素(tb让)降低，白 蛋白(alb)升高；肝脏抗氧化能力下降得以抑制；抗氧化 酶谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)、超氧化物歧化酶(sod) 活性升高，谷胱甘肽(gsh)、丙二醛(mda)降低；炎症因 子il-1b, il-6水平降低；肝指数减少；白血病细胞对肝 小叶浸润减少，且凋亡率增加。aps+ara-c联合治疗后肝脏 病理恢复更加显著。综上所述，aps和ara-c可减少肝脏内 白血病细胞聚集，降低肝功能损伤和炎症因子水平，提高肝 组织抗氧化能力，提示aps+ara-c联合治疗可以发挥更好作 用。关键词k562细胞株；人白血病小鼠模型；当归多糖; 阿糖胞昔；肝损伤收稿日期2013-0

3、7-31基金项目国家自然科学基金项目(81173398)通信作者*王亚平，教授，博士生导师，tel: (023) 68485968, e-mail： ypwangcqaliyun. com白血病是造血系统的恶性肿瘤，白血病细胞具有较强的 游走能力，很容易离开原发部位进入血液并浸润肝脏、肺等 非造血器官。迄今，治疗白血病的药物主要以非靶向细胞毒 药物为主，如甲氨蝶吟、6疏基嚓吟、阿糖胞昔等，它们对 正常的组织细胞也会造成严重损害。肝脏是大多数药物分解 代谢的器官，抗肿瘤药物在治疗肿瘤时对肝脏损伤值得高度 关注。有研究证明，抗白血病药物在肝脏内潴留时间较短， 且药物浓度相对较低，这些因素可能使肝脏

4、成为白血病细胞 的庇护所1。当归多糖(angelica polysscharides, aps)是传统 补血中药当归的主要有效成分之一。本室既往研究表明，aps 对正常细胞和肿瘤细胞存在双向调节作用，即aps既能促进 造血干/祖细胞的增殖分化，又能抑制白血病细胞的增殖并 诱导其向成熟方向分化2-3 o本研究在成功建立人白血病 nod/scid小鼠模型基础上，通过aps,阿糖胞昔(ara-c) 单独以及联合治疗白血病模型小鼠，观察在治疗白血病时对 肝脏形态与功能的影响及其相关作用机制。1材料与方法1. 1动物 雄性nod/scid小鼠，810周龄,体重18 23 g,由重庆医科大学实验动物研究所

5、提供。1.2药品、试剂与仪器当归多糖购自陕西慈缘生物技 术有限公司（批号cy130421,甘肃岷县当归提取，纯度95%, 注射用生理盐水配制为20 g l-1,过滤除菌）。阿糖胞昔（国 药准字h20055127,相对分子质量279. 68,注射用生理盐水 配制为2. 5 glt）。sod, mda, gsh, gsh-px购自南京建 成生物工程研究所。il-ib , il-6elisa试剂盒购自武汉博 士德生物工程有限公司。tunel试剂盒购自碧云天生物技术 研究所。550酶标仪（biorad）, cm 1950冰冻切片机（leica）, ix71-a12fl/ph 荧光显微镜（olympus

6、）, hfx-iia 光学显微 镜（nikcon）o1. 3人白血病小鼠模型的建立动物随机分为正常组、 模型组、当归多糖治疗组（aps组）、阿糖胞昔治疗组（ara-c 组）、当归多糖与阿糖胞昔联合治疗组（aps+ara-c组）。除 正常组注射等量生理盐水外，其余组按本课题组方法，建立 移植性人白血病nod/scid小鼠模型4,即给小鼠腹腔注射 环磷酰胺每只2 mg, qd, 2 d,第3天从尾静脉注射移植对 数生长期k562细胞（2x107个/只），接种k562细胞30 d 后模型建立成功。从第31天开始分别腹腔注射aps （200 mg kg-1 dl), arac (2. 5 mg kg-

7、1 dl)以及 aps (200 mg kg-1 dt) +arac (2. 5 mg kg-1 dl)联合治疗各 组小鼠，共14 d,接种k562细胞45 d处死小鼠取材。1.4外周血白细胞计数与分类和肝功能检测 各组小鼠 取尾静脉血，自动血细胞分析仪测定白细胞总数，血涂片经wrightz s染色,光镜下分类计数。取小鼠眼球血制备血清, 全自动生化仪检测alt, ast, alb, tbil等肝功能指标。1.5肝指数与肝组织病理学检查颈椎脱臼处死小鼠前 称各组小鼠体重，迅速取下整体肝脏，吸去血液后称肝脏质 量。按公式计算肝指数：肝指数二肝脏湿重(mg) /体重(g)o 取各组小鼠新鲜肝组织进

8、行冷冻切片，厚度10 um, he和tunel染色，观察肝脏病理形态学与细胞凋亡情况，具体操作按照说明书进行。1.6肝组织抗氧化能力的检测各组小鼠分别取0.5 g 肝组织，制备10%的组织匀浆，留取上清用于后续检测。bca 蛋白浓度测定试剂盒检测各组上清液的蛋白浓度，sod, mda, gsh, gsh-px检测按照试剂盒说明书进行。1.7肝组织炎症细胞因子反应检测1.6项步骤制备的 上清用于检测il-1b, il-6,具体操作方法均按照说明书进 行。1.8统计学处理 所有数据以土s表示，运用spss17.0统计软件进行单因素方差分析，lsd法进行组间两两比较，以p 表4肝组织内凋亡细胞阳性率

9、(土s, n二5)table 4 the apoptotic positive cell rate of theliver among the groups （±s, n二5）有研究发现，白血病细胞可分泌il-6和il-8调节自身 的生长8,并能作用于白血病干/祖细胞，还能调节免疫系 统b细胞功能9。临床研究发现，初治白血病患者il-6水 平明显增高，提示白血病发病初期肿瘤细胞能分泌该类炎症 因子，治疗后肿瘤细胞负荷减少，炎症因子的生成也相对减 少10。本实验观察到，模型组小鼠肝脏内有大量白血病细 胞浸润，分析结果显示肝组织中il-1b和il-6水平显著增 加，经aps, ara-c

10、单独以及aps+ara-c联合治疗后白血病 细胞在肝脏内浸润减少，且il-1b和il-6水平也显著降低, 这提示白血病细胞可分泌炎症细胞因子，且aps在体内对白 血病细胞有抑制作用。本实验通过检测抗氧化酶sod, gsh, gsh-px的活性和 脂质氧化mda的含量，分析肝脏的抗氧化损伤能力的改变。 研究结果表明，模型组小鼠肝组织sod, gsh, gsh-px的活 性显著降低，mda含量显著升高，提示白血病细胞在肝脏内 的聚集以及促炎症细胞因子的高表达使得肝脏抗氧化损伤 能力失衡，将造成肝脏严重损害°aps治疗后肝脏sod, gsh, gsh-px活性显著升高，mda含量显著下降，

11、提示aps可提高 肝组织的抗氧化能力，对肝脏有一定保护作用。ara-c单独 以及aps+ara-c联合治疗后白血病细胞在肝内聚集显著减 少，抗氧化能力得到一定恢复。本实验通过检测各组小鼠血清alt, ast, alb, tb让指 标了解肝脏受损情况。结果表明，模型组与正常组相比alt, ast, tbil均增加，alb含量显著降低，提示肝内白血病细 胞的浸润以及炎症因子水平的增加，肝脏抗氧化能力减弱导 致肝细胞严重损伤。aps治疗后，alt和ast显著降低，肝 功能损伤得到一定抑制；ara-c组以及aps+ara-c联合治疗 组alb和肝指数显著降低，tbil显著升高，alt, ast无明 显

12、变化，提示白血病细胞浸润率及淤滞程度严重组alt, ast, tbil并不高于化疗组，说明alt, ast, tbil的增高与化疗 密切相关，因此白血病进行化疗时应注意保护肝脏。组织细胞发生凋亡时，会激活一些可切断核小体间的基因组dna的内切酶，基因组dna断裂后暴露的3 -0h可以在tdt的催化下加上荧光素标记的dutp,通过荧光显微镜即可检测。tunel法最大的优点是能特异性检测细胞凋亡时产 生的dna断裂。本实验通过tunel染色结果表明，治疗组与 模型组相比，凋亡细胞阳性率显著增加，提示aps, ara-c单独以及aps+ara-c联合在体内均能诱导白血病细胞凋亡lljo综上所述，ap

13、s治疗白血病模型小鼠是通过抑制白血病 细胞的生长，提高肝组织抗氧化损伤能力，降低炎症细胞因 子水平，诱导白血病细胞凋亡，以此改善白血病肝脏浸润所 致的肝损伤。aps+ara-c联合治疗时有一定增效作用，但是 阿糖胞昔治疗中对肝脏造成的损伤不容忽视。提示 aps+ara-c联合治疗时增加aps的药物浓度，降低ara-c药 量和作用时间疗效会更显著。参考文献1 马玉花，邹亚伟，陈福雄.白血病肝损伤的研究进 展j中国小儿血液与肿瘤杂志，2013, 18 (2)： 93.2 华自森，宋姝丹，罗春燕，等.当归多糖协同epo 对造血干/祖细胞jak2/stat5信号传导通路的影响j 中国 中药杂志,200

14、9, 34 (24)： 3268.3 郑敏，王亚平.当归多糖对k562细胞增殖抑制与诱 导分化的实验研究j.中国中西医结合杂志，2002, 22(1)： 54.4 陈地龙，李静，王亚平，等.移植性人白血病小鼠 模型的建立j.重庆医科大学学报，2006, 31 (2)： 204.5 tsutsumi h, murai y, mizutani r, et al. plasmaconcentration of cytosine arabinoside (arac) in the elderly patients with hematological malignancy treated by ara

15、c or cytarabine ocfosfate (spac)j nihonronen igakkai zasshi,1995,32 (3)： 190.6 张先平，王乾兴，陈斌，等.当归多糖抑制氧化损 伤延缓造血干细胞衰老j中国中药杂志，2013, 38(3)：407.7 qin t, chen j, wang q, et al. selenylationmodification can enhance immune-enhancing activity of chinese angelica polysaccharide j. carbohydr polym, 2013,95 (1)： 1

16、83.8 denizot y, fixe p, praloran v, et al. seruminterleukin-8 ( il8 ) and il-6 concentrations in patients with hematologic malignanciesj blood , 1996,87 (9)： 4016.9 reynaud d, pietras e, passegu e e, et al.il6 controls leukemic multipotent progenitor cell fate and contributes to chronic myelogenous

17、leukemia developmentj. cancer cell,2011 ,20 ( 5 ) ： 661.10 石建霞，顾健，马莉，等白血病患者炎症因子-vegf 表达与易栓状态关系的研究j.血栓与止血学，2008, 14(6)： 261._11 lv y, zeng l, xing w, et al. systematic dielectrophoretic analysis of the ara-c-induced nb4 cell apoptosis combined with gene expression profilingj. int j nanomed, 2013,8： 2

18、333.effect of combined administration of angelicapolysaccharide andcytarabine on liver of human leukemia nod/scid mouse modelzhu jia-hongl, xu chun-yanl, mu xin-yil, liu junl, zhang meng-sil, jia dao-yongl,zhang yan-yanl, huang guo-ning2, wang ya-pingl* (1. laboratory of stem cell and tissue enginee

19、ring, department of histology and embryology,chongqing medical university, chongqing 400016, china；2. chongqing reproductive and genetic institute, chongqing maternal and child health hospital , chongqing 400013, china)abstract leukemia is a type of malignant tumors of hematopoietic system with the

20、abnormal increased immature leukemia cells showing metastasis and invasion ability liver is one of the main targets of the leukemia cells spread to, where they may continue to proliferate and differentiate and cause liver function damage, even liver failure out previous studies showed that angelica

21、polysscharides (aps), the main effective components in angelica sinensis of chinese traditional medicine, was able to inhibit the proliferation and induced differentiation of the leukemia cells, however, its effect on the liver during the treatment remains elucidated. in the presentstudy,the human l

22、eukemia nod/scid mouse model wereestablished by implantation human leukemia k562 cellsline,then the leukemia mouse were treated with aps,ara-cor aps+ara-c respectively by peritonealinjection for 14 days , to explore the effect andmechanism of the chemicals on the mouse liver. compared to the human l

23、eukemia nod/scid mouse model group with the treatments of aps, arac and aps+ara-c, we found that severe liver damage and pathological changes of the liver were able to alleviate： first, the number of white blood cells in the peripheral blood was significantly lower and with less transplanted k562 le

24、ukemia cells； second, liver function damage was alleviated as liver function tests showed that alanine aminotransferase (alt), aspartate aminotransferase (ast) and total bilirubin (tbil) were significantly reduced , while the albumin ( alb ) was notably increased ； third , liver antioxidant ability

25、was improved as the activities of the antioxidant enzymesglutathione peroxidase ( gsh-px ) and superoxide dismutase (sod) were significantly increased, and the contents of gsh and malonaldehyde (mda) were decreased significantly in the liver； fourth, the inflammation of the liver was relieved as the level of il13 and il6, the inflammatory cytokines, were decreased significant