尼龙固定化木瓜蛋白酶PPT课件VIP

1、中南民族大学 药学院化学生物学教研室尼龙固定化木瓜蛋白酶尼龙固定化木瓜蛋白酶化学生物学实验1.1.实验目的实验目的化学生物学实验6学时12学习尼龙固定化木瓜蛋白酶的原理和方法。掌握共价结合法固定化酶的原理和方法。中南民族大学 药学院化学生物学教研室2.实验原理实验原理化学生物学实验6学时1234酶不与产品酶不与产品混合，制品混合，制品易于纯化。易于纯化。在大多数情况在大多数情况下，可提高酶下，可提高酶的稳定性。的稳定性。提高酶的使用提高酶的使用效率，降低生效率，降低生产成本。产成本。利用固定化酶，利用固定化酶，工业上可以大批工业上可以大批量、连续化生产量、连续化生产定义：定义：通过物理或化学的

2、方法，将水溶性的酶与水不溶性载 体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内 进行催化反应的酶称为固定化酶。固定化酶的固定化酶的优越性主要优越性主要表现在：表现在：2.实验原理实验原理化学生物学实验6学时包埋法共价键结合法交联法酶的固定化方法有：酶的固定化方法有：吸附法(物理吸附、离子吸附)12342.实验原理实验原理化学生物学实验6学时 本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键经经HCl水解后，产生游离的水解后，产生游离的-NH2基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个中的一

3、个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙基缩合，形成尼龙(载体载体)-戊二醛戊二醛(交联剂交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。酶，即尼龙固定化酶。NH(CH2)6NHCO(CH2)4COn HClR-CH2-NH2OHC-CH2-CH2-CH2-CHOR-CH2-N=CH-CH2-CH2-CH2-CHO目标产物目标产物3.实验材料、试剂及仪器实验材料、试剂及仪器化学生物学实验6学时材料材料(1)尼龙布(86或66)，140目，剪成3 cm3 cm大小的方块(2)吸水纸仪器仪器 (1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)

4、冰箱及玻璃器皿中南民族大学 药学院化学生物学教研室3.实验材料、试剂及仪器实验材料、试剂及仪器化学生物学实验6学时 (1)18.6% CaCl2(1)18.6% CaCl2溶液溶液 (2)(2)甲醇溶液甲醇溶液 (3)3.65 mol/LHCl(3)3.65 mol/LHCl溶液溶液 (4)0.2 mol/L(4)0.2 mol/L硼酸缓冲液硼酸缓冲液(pH(pH值值8.5)8.5) (5)5% (5)5%戊二醛溶戊二醛溶: :用用0.2 mol/L,pH0.2 mol/L,pH值值8.58.5的硼酸缓冲液配制的硼酸缓冲液配制 (6)0.1 mol/L(6)0.1 mol/L硼酸缓冲液硼酸缓冲

5、液(pH(pH值值7.8) 7.8) (7)1 mg/mL (7)1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液木瓜蛋白酶溶液 (8)0.1 mol/L(8)0.1 mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液( (含含3% NaCl) (pH3% NaCl) (pH值值7.2)7.2) (9)0.1 mol/L (9)0.1 mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH(pH值值7.2) 7.2) (10) (10)激活剂：用激活剂：用0.1 mol/L0.1 mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH(pH值值7.2)7.2)配制，内含配制，内含 20 mmol/L20 mmol/L半胱氨酸、半胱氨酸、1 mmol/LEDTA1 mm

6、ol/LEDTA的混合液。的混合液。 (11)1%(11)1%酪蛋白溶液：用酪蛋白溶液：用0.1 mol/L0.1 mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH(pH值值7.2)7.2)配制。配制。 (12)10%(12)10%三氯乙酸三氯乙酸(TCA)(TCA)溶液。溶液。主要试剂主要试剂4.实验步骤实验步骤1 1、固定化酶的制备、固定化酶的制备 (1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入10 mL混合液（取1.86 mL 18.6%CaCl2溶液加入8.14 mL甲醇溶液中，注意要现配现用） 中10s左右，取出后用水冲洗 、干净，用吸水纸吸干。 (2)尼龙布用3.65 mol/L HCl溶液在室温下水

7、解45min，用蒸馏水 冲洗三次至pH中性。 (3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20 min。 (4)取出尼龙布，用0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.2)反复洗涤， 洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液(0.51 mg/mL)在 4下固定3.5 h(酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8 mL)。 (5)从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用 0.5mol/LNaCl溶液(用0.1 mol/L，pH值7.2的磷酸缓冲液配制)洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。化学生物学实验6学时4.实验步骤实验步骤化学生物学实验6学时2、酶活力测定、酶活力测定(1)溶液酶活力测定：取0

8、.2 mL酶液，加入2.3 mL激活剂，于 37 下预热10min，加入37预热的1%酪蛋白溶液mL， 准确反应10 min，然后加入10%三氯乙酸溶液1.5 mL终止 酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶 液，其他与测定管相同，以8000 r/min的转速离心10 min或 过滤，取其上清液于波长280 nm处测定吸光度。在上述条 件下，每10 min增加0.001个吸光度为1个酶单位(U)。(2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。(3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.5mL激 活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。4.实验步骤实验步骤化学生物学实验6学时表1

9、酶活力测定试剂试剂溶液酶溶液酶固定化酶固定化酶残留酶残留酶CK12CK12CK12激活剂（mL）1.81.81.82.02.02.01.81.81.8酶液/固定化酶（mL或块）0.20.20.21块1块1块0.20.20.237保温5min37 1%酪蛋白（mL）11111137反应10 min20% TCA (ml)摇匀2222222221%酪蛋白（mL）111过滤5.实验数据处理及计算实验数据处理及计算化学生物学实验6学时活力回收活力回收=固定化酶总活力数固定化酶总活力数溶液酶总活力数溶液酶总活力数100%相对活力相对活力=固定化酶总活力数固定化酶总活力数(溶液酶总活力数溶液酶总活力数-残留酶活力数残留酶活力数)100%6.注意事项注意事项尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。地活化，又不能