生物工艺学重点(上半部分)

1、发酵工艺学发酵工艺学的定义和特点生物工艺学：应用自然科学及工程学的原理，依靠生物作用剂的作用将物料进行加工以及提供产品为社会服务。工业上的发酵：指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程。生物作用剂（生物催化剂）：是游离的或固定化细胞、酶的总称微生物细胞，在生物过程中起着催化作用。生物反应过程是六部分组成：原料预处理、种子培养（扩大）、空气除菌（好气性发酵）、发酵（主要阶段）、提炼、成品检验发酵工程特点：（1） 发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单；（2） 发酵所用的原料简单粗放。通常以淀粉、糖蜜、或其他农副产品为主； （3） 发酵过程是通过生物体的

2、自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单一的代谢产物； （4） 发酵过程中对杂菌的污染防治至关重要； （5） 由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性的和高度选择性的对某些较为复杂的化合物进行特定部位的氧化、还原等化学反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物； （6） 微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此使得按常规方法； （7） 投资少、见效快、经济效率显著。代谢控制发酵：利用生物化学或遗传学的方法，人为地改变或控制微生物代谢，使其有用产物大量积累的方法。糖类好气性代谢产物特点：（1）好气性微生物，有氧呼

3、吸好气发酵。菌体生长速度降低或停止生长时，产物才能大量生长；（2）代谢途径清楚；产物可分为两类：1、糖类经过降解途径TCA、DCA循环途径的发酵产物。2、糖类碳链不经过降解的发酵产物。（3）与消耗碳源无准量关系。次级代谢产物定义：既不作为细菌或酶的结构成分，也不是一般的细胞储存物质，它对产生菌本身的生理功能物不明确的一类代谢产物。特点：（1）与消耗碳源无准量关系，产量很低； （2）菌生长速度减低或停止后，产物较快合成，也有例外； （3）合成途径复杂，多不明确甾体转化物。产物： 抗生素类：青霉素、链霉素、四环素、庆大霉素、维生素B12、植物激素、赤霉素、真菌毒素发酵法优点：（1）简化步骤；（2）

4、提高转化产物的疗效；（3）反应多，不同微生物进行不同的反应；（4）有利环境保护，提高人体健康。培养基定义：指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物提供除营养外的其他生长所必需的条件。（营养、环境条件）要求：（1）都必须要含有作为合成细胞组成的原料； （2）满足一般生化反应的基本条件； （3）一定的PH条件； （4）工业生产培养基所用的原材料还必须满足：来源丰富，价格低廉，质量稳定；根据生产菌的营养特性与产物合成两者兼顾；符合工艺、设备的要求（配制培养基时要有利于发酵液质量）。培养基成分碳源：形式：糖类、油脂、有机酸、低碳醇等主要功能：为微生物菌种的生长繁殖提供

5、能源和合成菌体所必需的碳成分；为合成目的产物提供所需的碳成分。快速利用的糖为培养基，有时反而会抑制产物合成，在菌体生长过程作为碳源的来源。慢速利用的糖为培养基，常会促进产物合成，在产物合成过程作为碳的来源。原因：快速利用碳源的分解产物抑制了产物形成的关键酶生产上采取的方法：（1）缓慢利用碳源的使用（2）流加葡萄糖（3）用混合碳源氮源：（1）种类：有机、无机（2）作用：构成细胞构质，含N代谢物（3）不同氮源差别有机氮源无机氮源 与有机N相比，更容易被微生物吸收 生理酸性物质：经微生物生理作用，能形成酸性物质的无机氮源生理碱性物质：经微生物生理作用，能形成碱性物质的无机氮源无机盐及微量元素：作用：

6、为微生物生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。一般低浓度时，对微生物合成产物促进，高浓度对微生物合成产物形成抑制。各元素作用 P：核酸和蛋白质必要成分，ATP，代谢调节；Ca：细胞透性；Mg：多数酶激活剂，芽孢的重要成分；S：含硫AA的组成和某些酶（CoA）活性剂；Fe：细胞色素，细胞色素氧化酶和过氧化酶成分；Cl：啫盐菌必需，改善啤酒味；Na+，K+：Na维持渗透性，K渗透压和透性；微量元素：酶的辅基和激活剂，机体对其需求很少生长因子：微量的一类调节微生物正常代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的有机物。培养基配置原则：（1） 营养物质应满足微生物需要；（2）营养物浓度及配比应当适

7、当；（3）物理化学条件合适；（4）根据培养基的目的。种子扩大培养定义：将休眠的生产菌种经斜面培养基活化，经扁平或摇瓶及种子罐逐级扩大数量，至一定数量和质量的纯种的过程。种子培养任务：保持生产菌种的优良生产性能，得到比较纯净的种子，菌健壮，还要有足够的量，以供大规模生产用，好坏关系到产物产量和质量。生产菌种的基本要求：（1）高产稳产性能、合成能力高，遗传性相对稳定，菌种不衰退，难变异；（2）要求粗放，较易培养，生长繁殖较快，可利用比较多的原料，比原料要求经济易得；（3）非病原菌，对发酵操作如此，且发酵产品用于食品、医药有很大部分，用于此类的菌还要求不产生毒素；（4）最好能耐受自身代谢产物，最好是

8、可耐高低温，可耐高温则热天可生产，省下冷却水，最好可耐酸、碱，产泡沫少，泡沫多需消耗消泡剂多，产品提炼困难。防止菌种变异衰退：（1）适宜的保存方法，主要原理是利用低温、干燥、真空，如斜面、砂土、矿物油；（2）限制使用期：斜面12月移植，砂土12年；（3）减少传代次数，限制菌种的开启次数，为防染菌；（4）定期分纯，用单细胞或单孢子分离，分离后的单细胞要进行生产能力的测定，要求不低于原有菌种。大的接种量优点：（1）缩短发酵罐中菌的生长期，产物合成时间提前，则整个合成时期就增加了，不少种子液中会有水解酶类，利于发酵利用；（2）有效地防止，发酵罐的前期染菌。缺点：（1）要求种子罐多；（2）种子液中含代

9、谢废物、副产物。发酵罐中可能抑制菌的生长的产物的合成。细菌：生长快，种子用量比例少，级数比较少，二级发酵霉菌：生长较慢，如青霉，三级发酵放线菌：生长慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌、放线菌快，通常用一级种子注意：（1）级数越少越好，简化工艺控制，减少染菌机会； （2）种子罐太少，接种量少，发酵时间延长，增加染菌机会； （3）工艺条件也会影响级数。种子质量标准：（1）细胞或菌体 菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）（2）生化指标 种子液：糖、氮、磷含量和PH变化（3）产物的生成量（4）酶活力 测关键酶活力种子质量的判断：（1） 培养基；（2）培养条件；（3）种龄（指种子罐里培养的菌丝体开始

10、移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间）。分批发酵定义：一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。特点：环境在发酵过程中不断变化。物理、化学、生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的体系。优点：操作简单，操作引起染菌的概率低，不会产生菌种老化和变异等稳定。缺点：非生产时间较长，设备利用率低。连续发酵定义：培养基料液连续输入发酵罐并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的PH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。优点：能维持低基质浓度，可提高设备利用率和单位时间产量，便于自动控制。缺点：菌种发生变异可能性大，

11、要求严格的无菌条件。半连续（补料分配比）发酵定义：在发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。优点：使发酵系统中维持很低的基质浓度和连续相比，不需要严格的无菌不产生菌种老化、变异等问题。缺点：存在一定的非生产时间和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。类型：（1）补料方式：连续流加、不连续流加、多周期流加 （2）补料成分：单一组分流加多组分流加 （3）控制方式：反馈控制、无反馈控制类型 （1）特点：分为两个时期：菌体生长期、产物形成期；C源利用的比速度有两个高峰，在产物形成期菌株第二次生长；C源利用和产物形成无明确的化学剂量关系，但还是有一定关系。（2）产物类型：在产物形

12、成时有中间产物积累无中间产物积累连续发酵动力学控制方法（1） 恒浊法：根据培养液的浊度与菌的浓度成正比，通过一种仪器（如光电效应）控制菌的流量，使菌的浓度保持一致。（2）恒化法：培养基中有一种可限制菌的生长速度，此为限制生长基质，控制菌浓度。温度对发酵的影响及其控制生物热：在发酵过程中，由于菌体生长繁殖和形成代谢产物，不断地利用营养物质，将其成分分解氧化获得能量（碳水化合物、脂肪、蛋白质分解为二氧化碳、氨气等），其中一部分能量用于合成高能化合物，供合成细胞物质和合成代谢所需的能量。其余部分则以热的形式散发出来。生物热用途：合成高能化合物，供微生物生命代谢活动，热量散发。发酵热的测定：（1）冷却

13、水流量，进出口温度；（2）罐温自动控制，罐温达到恒定再关闭，测温度随时间上升的速率。温度对发酵的影响1、T低，反应速度低，周期长；2、T高，反应速度低，但菌易衰老，影响产量；3、菌合成与产物合成温度要求不同。温度通过以下方式影响发酵过程1、 影响各种酶的反应速率和蛋白质性质；2、 影响发酵液物理性质；3、 影响生物合成的方向。最适温度的确定：在该温度下最适干菌的生长或发酵产物的生成。温度的控制 发酵罐：夹套（10立方米以下）、盘管（10立方米以上）微生物的耗氧量及氧的供给影响：生长代谢、改变代谢途径需氧量与以下因素有关（1）菌种特性（2）生理状态（3）培养基成分与浓度（4）细胞浓度（5）温度氧

14、的传递：（1）搅拌成为细胞，阻力有培养液和微生物细胞；（2）氧不足，微生物缺氧窒息；（3）耗氧，溶氧要平衡；（4）溶氧低于耗氧，氧下降生长受影响。提高培养液溶解氧速率常用方法：1、提高氧分压（1）通入的空气中掺入纯氧（2）提高罐压；2、提高氧的吸收速率（最重要的一种方法）（1）搅拌，适合细菌生产（2）提高通气量，带走液体水分使发酵液浓缩；3、降低培养液粘度，粘度越大，就湍流下降，液膜变厚，气泡越稳定性；4、降低培养液温度，在允许的条件下降低，可增加溶解速率；5、添加某些物质增加溶氧。表面活性剂可增加溶氧，但不得对菌生长产生影响，不使产物提纯度难，要经济；6、与培养液液柱体积有关。PH对发酵影响

15、引起PH下降的因素：（1）CN比C过多，中间补空气溶氧不足；（2）消泡油过多；（3）生理酸性物存在，氨被利用引起PH上升的因素：（1）CN比N过多，AA释放；（2）中间补料中氨水或尿素等碱性物加入过多；（3）生理碱性物质过多PH值控制：（1）培养基的配比；（2）中间补料控制PH值，补Glc或补氨水、尿素；（3）PH电极控制加补料或酸、碱来控制PH二氧化碳对发酵影响（1）二氧化碳对微生物的生长速度具有刺激或抑制作用（2）影响发酵液酸碱平衡从而影响产物的合成控制：通常通过调节痛通风和搅拌来控制基质浓度对发酵影响及补料控制补料的作用：（1） 可以控制抑制底物的浓度（2） 可以解除或减弱分解产物的阻遏

16、（3） 可以使发酵过程最佳化补料优点：（1）控制营养物质浓度控制菌生长速率，不致太快衰老，自溶推迟，达到增加合成时间，提高产量作用（2）作为控制，扭生异常发酵的手段（3）增加发酵液的总体积补料的依据和判断 最常用的是残糖浓度、溶氧浓度和PH。糖的浓度大，代谢加快溶氧浓度降低。糖的浓度降低，利用氮源中提供能量造成氨积累，PH升高。泡沫的产生影响、控制泡沫产生原因：（1） 通气和搅拌（2） 代谢气体逸出，和生长阶段有关（3） 培养基中糖、蛋白质、代谢物等表面活性物质是产生泡沫的主要因素，糖增加了泡沫的稳定性。（4） 灭菌温度高，冷却时间长都会使泡沫增加。泡沫造成影响：（1） 降低装料系数；（2）增

17、加菌群非均一性；（3）泡沫升至罐顶增加染菌机会；（4）导致产物损失；（5）消泡剂的加入增加提取困难。泡沫的控制：机械搅拌（不引入外界物质，但未从根本解决）、消泡剂（效果好，但引入外界物质影响提纯）发酵染菌的防治处理污染：微生物发酵为纯种发酵，如有其他菌侵入称为污染（杂菌污染、噬菌体污染）杂菌污染的防治与挽救表现：（1）生产菌生产受抑制，测OD值，菌浓度下降； （2）C、N消耗加速，PH值的不正常变化； （3）泡沫一般增多，粘稠颜色加深，使培养液发酵发臭； （4）发酵周期缩短，产量下降。引起染菌的主要途径和原因1、种子培养阶段可能染菌生产菌种在保存、转移时种子扩大培养，种子罐可能染菌，培养基带菌

18、防治方法：抗污染强的菌株，定期进行分离，严格无菌操作，培养基首先要进行无菌试验，种子本身也要无菌试验。2、培养基要求灭菌彻底。冷空气排除不彻底造成假压，有空气混入水蒸汽（三路进气：列管、排料管、进空气管）防止蒸汽走短路，由于空气走阻力小的管路负压抽吸，无菌空气保压泡沫过多（由于其传热性差，使其中杂质保留）3、空气系统 过滤系统出问题，主要是过滤介质失效4、设备渗透 安装不当，有死角存在杂菌类型 染芽孢：设备死角，使芽孢存活，培养基不彻底 染霉菌：培养基灭菌不彻底 染球菌：大部分从空气来，主要是空气过滤系统失效 染G-：大部分从水中来，是由于设备的渗透发酵染菌的原因及防止 1、种子带菌的原因 无菌室的无菌条件不符合要求；培养基灭菌不彻底；操作不当。种子罐染菌：先灭菌再倒灌，再空消取用备种或倒种发酵罐染菌：根据染菌时间不同采取相应的方法 前期染菌：染菌危害不大，采取补种方法，使生产菌在发酵罐中占绝对优势染菌危害大先补加营养再重新灭菌，再接种；染菌危害极大，先