基于主成分研究不同初加工方法大黄蒽醌和酚酸类成分比较探究

1、基于主成分研究不同初加工方法大黄恿醍和酚酸类成分比较探究摘要该实验目的是对10种不同初加工方法的 大黄药材中的恿醍类及酚酸类成分进行比较研究，探索大黄 产地加工方法对成分的影响。利用hplc同时测定芦荟大黄 素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲瞇、没食子酸、儿 茶素7个主要成分含量，利用紫外分光光度法测定了总酚酸 含量。采用spss软件进行了主成分分析，利用主成分得分 进行大黄评分评级。不同的初加工方法大黄药材总蔥醍类成 分含量变化呈现一定的规律性，大黄釆收后是否趁鲜切制以 及如何干燥，直接影响其有效成分葱醍及酚酸的含量。结果 表明奉节产大黄烘干大块干货评分最高，支根总蔥醍和酚酸 均比主根含量

2、高，水润过程产生提高;t醍类物质含量及降低 酚酸类物质含量作用。关键词大黄；主成分分析；初加工；恿醍；酚酸； hplc；含量测定收稿日期2013-10-16基金项目重庆高等职业技术院校应用技术推广中心 新技术推广项目通信作者*高文远，tel: (022) 87401895, e-mail：pharmgaotju. edu. cn作者简介付绍智，e-mail： fushaozhisina. com大黄享有我国传统中药“四大金刚”之一的美誉，是我 国四大最常用的中药之一。重庆三峡地区奉节及毗邻的湖北 利川是大黄的传统道地产区，植物来源为药用大黄rheum officinale bail.,商品上习

3、称"马蹄大黄”。 大黄的传 统加工方法主要有熏干法、烘干、阴干2等，其产地加工 无技术指南，存在一定的盲目性和随意性。2010年版中国 药典一部大黄项下也只是简单阐述大黄采挖后如何加工， 没有其产地加工品及质量的相关记载。大黄采收后是否趁鲜 切制以及如何干燥，直接影响其主要药效成分蔥醞类及酚酸 物质的含量3-4 o游离蔥醍类成分为大黄的主要药效成分 之一 5,本文以蔥醍类和酚酸类成分含量为评价标准，利 用hplc直接测定不同初加工方法对大黄中5种蔥醍类和2 种酚酸成分含量的影响，探讨了蔥醍类和酚酸类成分在大黄 初加工过程中的变化规律，为大黄药材质量标准的制订及其 产地初加工技术改进提

4、供依据。1材料waters 1525-2998高效液相色谱系统,安捷伦hp 1100 色谱仪，g1311a四元泵，hprev. a. 0501化学工作站；cp225d 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；kh-250b型 超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）;wnd-200型高速 中药粉碎机（浙江省兰溪市伟能达电器有限公司）。大黄素购自中国食品药品检定研究院（批号 110756-200100）；芦荟大黄素（纯度98%）,大黄酸（纯度 98%）,大黄酚（纯度98%）,大黄素甲瞇（纯度98%）,儿茶 素（纯度98%）,没食子酸（纯度98%）均购自金测分析技术 有限公司（天津）；浓盐酸，磷

5、酸，三氯甲烷，无水碳酸钠 均购自天津江天化工有限公司；福林酚试剂购自天津市光复 科技发展有限公司；纯净水购自娃哈哈集团公司；色谱纯甲 醇购于康科德科技有限公司。大黄药材采自重庆奉节云雾乡及毗邻的湖北利川元堡 镇，原植物及药材经天津大学高文远教授鉴定为药用大黄 rh. officinale bail.,共10批,初加工方法见表1。2方法与结果2. 1 色谱条件 kromas订 c18 色谱柱（4. 6 mmx250 mm, 5 urn）, 5种;t醍类物质以甲醇-0. 1%磷酸溶液（85 : 15）为 流动相；检测波长254 nm。儿茶素和没食子酸的流动相为乙 月青（a） -0. 5%冰醋酸（b

6、）, 05 min, 2% a； 25 min, 8%a； 45 min, 12%a； 50 min, 80%a； 55 min, 2%a。检测波长 280 nm,理论板数按大黄素峰计算应不低于3 000o色谱图见图 1, 2o表1不同大黄样品的产地及加工方法table 1 producing areas and initial processing method of different processed products from rheumofficinale注：批号相同代表同一株大黄，批号不同代表不同株。1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚； 5.大黄素甲瞇。图1大黄对

7、照品(a)及样品(b)的蔥醍成分hplc图fig 1 hplc chromatograms of anthraquinones constituents of the standard mixture solution (a) and samples (b)1.没食子酸；2.儿茶素。图2大黄对照品(a)及样品(b)酚酸成分的hplc图fig.2 hplc chromatograms of phenolic acids of the standard mixture solution (a) and samples (b)2.2蔥醍类对照品制备精密称取芦荟大黄素、大黄酸、 大黄素、大黄酚、大黄素

8、甲瞇对照品适量，加甲醇分别制成 每1讥含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各16 ug, 含大黄素甲醞10 ug的甲醇溶液。2.3酚酸类成分对照品制备 精密称取没食子酸与儿茶 素对照品适量，配置成含没食子酸0. 341 3 gml-1与儿茶 素为0. 336 0 gml-1的甲醇溶液。2.4蔥醍类成分供试品的制备 取本品粉末0.15 g it 4 号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇25 ml, 称定质量，加热回流1 h,放冷至室温。再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 ml,置 烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 ml,超声处理2 min, 再加三氯甲烷1

9、0 ml,加热回流1 h,放冷至室温。置分液 漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并加入分液漏斗中，分 取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml, 合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干。残渣加甲醇使溶解， 转移至10 inl量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤 液即得。2.5酚酸类成分测定供试品的制备精密称取大黄药材粉末0.5 git 4号筛，置具塞锥形瓶中，精密加 入20%甲醇溶液25 ml,称定质量，超声处理40 min (120w, 50 hz),再称定质量，用20%甲醇溶液补足减失质量，摇匀, 滤过，取续滤液，即得。2.6总酚酸线性关系考察分别精密吸取上述对照品溶 液 0.

10、0, 0. 1, 0. 2, 0. 3, 0. 4, 0. 5, 0. 6 ml 于 20 ml 试管 中。分别加入蒸%留水 6, 5. 9, 5. 8, 5. 7, 5. 6, 5. 5, 5. 4 ml, 分别加入福林试剂1. 0 ml,充分振荡后静置34 min,以 及10% na2c03溶液1. 0 ml,摇匀置于25 °c恒温水浴中反 应2 h后于765 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，所得没 食子酸回归方程为y = 0. 012x-0. 036 8 (r2= 0. 999 5),线 性范围20100 ugo2.7单体类成分线性关系考察上述5种对照品分别逐 级稀释，依次稀释

11、到原来浓度的1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 依法测定，以进样质量浓度(nigl-1)为横坐标，峰面积 为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。在实验条件下对 上述混合对照品溶液进行分析，以进样浓度为横坐标，峰面 积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。所得回归方程分 别为芦荟大黄素y二22 504x+3 210.4 (r2=0. 999 4),大黄酸 y=8 978. 3x+669. 88(r2=0. 999 1),大黄素 y=30 447x+2 620. 1(r2=0. 999 2),大黄酚 y二49 466x-3 932 (r2=0. 999 8), 大黄素甲瞇 y=15

12、 475x-250. 54 (r2=0. 999 2)。结果表明， 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚种对照品分别在0. 005 00.160 0 ng线性关系良好，大黄素甲瞇在0.003 1 0. 100 0 pg线性关系良好。没食子酸y二26 043x-1.076 6(r2二0. 999 9),儿茶素 y二 6 600. 6x-18. 728 (r2=0. 999 7), 儿茶素在0. 105 03.360 7 u g线性关系良好，没食子酸 在0. 107 33.413 1 ug线性关系良好。2.8精密度试验精密吸取上述供试品溶液10 ul,重 复进样6次，依法测定，结果各对照品峰面积积分

13、值的rsd 均小于1. 5%o2. 9稳定性试验精密吸取上述供试液溶液10 ul,间 隔一定时间进样共6次，各对照品峰面积积分值的rsd均小 于1.4%,可见样品溶液在24 h内保持稳定。2. 10重复性试验 取大黄生片粉末6份，各约0.15 g, 精密称定，制备成供试品溶液，依法测定并计算含量，结果 各对照品6次测定值的rsd分别为1.0%, 0.56%, 0. 43%,0.48%, 0. 78%, 1.0%, 1.2%o2. 11加样回收率试验精密称定已知含量的大黄生片 粉末0. 15g,共6份，分别精密加入各对照品适量，按供试 品溶液制备及测定法操作，进行色谱分析。芦荟大黄素、大 黄酸、

14、大黄素、大黄酚、大黄素甲瞇、没食子酸、儿茶素的 加样回收率分别为 98. 99%, 98. 30%, 98. 90%, 98. 55%, 98. 90%, 98.12%, 9& 31%； rsd 分别为 1. 0%, 0.56%, 0.43%, 0.48%, 0. 78%, 1. 0%, 1.2%o2. 12样品含量测定按2.6, 2.7项下方法操作，平行 测定3份，于765 nm处测定吸光度，将所得平均吸光度带 入回归方程，计算各个品种大黄样品中总酚酸含量；7种单 体类成分进样10 ul进行hplc分析。不同初加工方法大黄 蔥酿含量测定结果见表2。表2不同初加工方法大黄恿醍及酚酸类成

15、分含量测定table 2 contents of anthraquinones and phenolic acids in different processed products from rheum officinale bailg g-1注：字母表示各样本间组间差异，相同字母表示2组数 据不存在显著性差异（p将不同大黄成分含量标准化数据与相应主成分得分系数的乘积相加得到大黄蔥醍和酚 酸含量的主成分得分。主成分得分可以反映加工方法对大黄 质量的影响，得分越高代表主要成分含量越高，即大黄质量 越好。从图中总得分排序结果可以看出，奉节产烘干大块干 货大黄评分最高质量最好，5, 6号样品仅次于8

16、号，即利川 产大黄质量均较优，且烘炕加工方法稍优于烟熏处理的大黄 质量。主根-鲜切段-干燥-水润-切片-干燥所得评分最低， 主根-鲜切段-干燥其次，图3可看出主根的芦荟大黄素、大 黄素、大黄酚及酚酸类物质含量均低于支根。因子载荷散点图和主成分分析图见图4, 5o结果显示， 大块干货-润透-切片-干燥的处理方法得到的大黄具有较高 含量的芦荟大黄素、大黄素、大黄酚类成分，但此加工方法 对酚酸类成分却产生了降低的作用。总体看来利川产大黄具 有较高含量的葱酿和酚酸类成分。图4不同成分的因子载荷散点图fig. 4 loadings plot of pca of different constituent

17、s图5 10批大黄样品的主成分分析得分图fig. 5 scores his to gram of pca 10 bat ches of rheum officinale bail3结论本研究中以hplc测定了大黄不同初加工方法药材中芦 荟大黄素等5种蔥醍昔元、2种酚酸类单体成分及总酚酸含 量，通过对大黄不同初加工方法的10批次不同药材的含量 测定，并以平均含量进行比较，对结果进行了主成分分析， 药材中5种蔥醍类和2种酚酸类成分的含量呈现一定的变化 规律。利用主成分分析有效地揭示大黄各成分含量与大黄质 量的关系。分析结果基本上反映了不同加工方法对大黄蔥醍 含量和酚酸含量的贡献率，可以看出奉节产烘

18、炕，大块干货 处理得到的大黄具有较高的葱酿类含量和酚酸类成分含量。 总体上烘干方法优于烟熏处理。从各成分含量结果分析可见，不同的初加工方法对大黄 药材质量的影响很大，大黄采收后是否趁鲜切制以及如何干 燥，切片还是切块都直接影响其有效成分蔥醍的含量。就5 种葱醍物质总含量来说，14号样品来自同一株大黄，1, 3 样品比对应2, 4号样品总恵醍含量低，此结果说明“鲜大 黄先切断块-干燥后-再润-再切片-干燥”的加工方法比 “鲜大黄直接切片-干燥”的加工方法所含总恿醍含量高， 同时说明了 “鲜大黄先切断块-干燥后-再润-再切片-干燥 的”的加工程序对总；醍含量产生了一个提高的作用，但对 酚酸类成分（

19、儿茶素、没食子酸）产生了降低的作用，此结 果在图3中也可得出，造成此影响可能是由于水润过程而产 生，所以以减少工序和人工用量的鲜切片集中加工方法还有 待进一步研究。此外，支根在大黄的产地加工中常作为丢弃 的部分，造成了严重的浪费。由本实验结果可以得出结论， 在产地初加工过程中大黄支根不仅不应该丢弃，且应该作为 优质原料进行加工利用。具有较高评分的5, 6, 8号样品的6, 8号样品均采用 烘干方法，结果初步推测烘干大块干货较优于烟熏方法，大 块干货较切片方法质量更好，且省时省力，此加工方法有望 在产地集中建立初加工厂中推广使用，具体优化方法有待于 进一步研究。参考文献 中国药典.一部s. 20

20、10： 22.2张村，李丽，肖永庆，等大黄5种药材中游离蔥 醍类成分比较研究j.中国中药杂志,2009,34(15)： 1914.3李芸，苗小楼，吴平安，等不同产地加工方法对 掌叶大黄药材质量的影响j.中药材，2011, 34 (8)： 1196.4李芸，苗小楼，吴平安，等.大黄不同品种不同产 地加工品的恿醍含量比较j.药物分析杂志，2012, 32(12)： 2257.5吴永江，陈建军，程翼宇.rp-hplc同时测定苦黄 注射液中4种大黄葱醍类成分含量j.中国中药杂志， 2004, 29 (11)： 1041.comparision of contents of anthraquinones

21、 and phenolic acids compoundsin different processed products from rheumofficinaleby principal component analysisfu shao-zhi, wang ting-ting, gao wen-yuan, li xia(1.chongqing three gorges medical college , chongqing 404120, china；2. school of pharmaceutical science and technology, tianjin university,

22、 tianjin 300072, china)abstract the aim of this study is to compare the contents of five types of anthraquinones which mainly in eludes chrysopha nol, physci on, emodin, rhein and physcion and phenolic acids in ten different processed products from rheum officinale, and to investigate the effect of different initial processing method on the contents of anthraquinones and phenolic acids. principal comp orient analysis (pca) was carried out by spss software to evaluate the quality of different processed products from rh. offici nale in con elusion,