第十一章动物细胞培养生物制药

1、第十一章 动物细胞培养生物制药动物细胞特点动物细胞特点1、动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏剪切力敏感感。2、动物细胞生长缓慢生长缓慢，易受污染。3、正常细胞培养的世代数有限世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。4、动物细胞间主要以聚集体形式存在，大多需要贴附在载体表面贴附在载体表面才能生长才能生长。此外，动物细胞具有细胞接触性抑制、密度抑制细胞接触性抑制、密度抑制的特点。动物细胞培养类型动物细胞培养类型动物细胞培养：动物细胞培养：是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。悬浮型细胞悬浮型细胞：动物细胞中只有极少数细胞极少数细胞体外生长

2、不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，称之为悬浮型细胞。血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞。贴附型细胞：贴附型细胞：大多数哺乳动物细胞必须附着在带适量正电荷正电荷的固体或半固体表面才能生长。贴壁依赖性细胞，大致分成四型：1 1、成纤维细胞型细胞、成纤维细胞型细胞2 2、上皮型细胞、上皮型细胞3 3、游走型细胞、游走型细胞4 4、多形型细胞、多形型细胞1 1、成纤维细胞型细胞、成纤维细胞型细胞细胞大致呈梭形或不规则形形或不规则形。成群细胞呈现放射状、旋涡状等形式。多数细胞之间排列疏散排列疏散，有较大的细胞间隙。成纤维细胞存在于肌肉、皮肤和骨骼中，代表有心肌细胞，血管内皮细胞等。2 2、上

3、皮型细胞、上皮型细胞细胞特点是：扁平扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形三角形及不规则扁平的多角形多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密紧密连接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现“铺路石状。代表有皮肤的表皮细胞、消化管与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等。3 3、游走型细胞、游走型细胞细胞特点是：呈散在生长，一般不连成片不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。代表有神经胶质细胞。4 4、多形型细胞、多形型细胞多形型细胞是一些形态上不规则的细胞。多形型细胞不常见，只有某些像神经组织细胞等难以确定其稳定形态的，才

4、可归于多形细胞。体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经原细胞。接触抑制与密度抑制 接触性抑制接触性抑制(Contact inhibition) 是某些动物细胞体外培养的生长特性之一。是指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象由于这个特性，正常细胞并不会相互重叠，而是呈单层细胞单层细胞生长。 密度抑制密度抑制(Density inhibition) 细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂。但是当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制现象动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件1、严格的无菌技术:细菌真菌支原体病毒交叉污染2、培养基 对于营养要求非常苛刻营

5、养要求非常苛刻，氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子等。包括：天然、合成、无血清培养基三种。（1 1）天然培养基）天然培养基 动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液、鸡胚胎汁等。 优点：营养价值高 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高血清的生物功能血清的生物功能1、提供基本营养：氨基酸、微生物、无机盐、脂类、核酸等、提供基本营养：氨基酸、微生物、无机盐、脂类、核酸等2、提供激素及各种生长因子：胰岛素、肾上腺素、类固醇、成纤、提供激素及各种生长因子：胰岛素、肾上腺素、类固醇、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等维细胞生长因子、表皮生长因子等3、提供结合蛋白：结合蛋白可以携带重

6、要的低分子量物质，如白、提供结合蛋白：结合蛋白可以携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带微生物、脂肪和激素，转铁蛋白携带铁等蛋白携带微生物、脂肪和激素，转铁蛋白携带铁等4、提供保护作用：如通过促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械、提供保护作用：如通过促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤，如血清蛋白可以增加培养基的黏度，保护细胞免受机械损伤，损伤，如血清蛋白可以增加培养基的黏度，保护细胞免受机械损伤，此外血清还提供一些微量元素和离子，防止细胞代谢中毒，如铯和此外血清还提供一些微量元素和离子，防止细胞代谢中毒，如铯和硒等。硒等。（2 2）合成培养基）合成培养基 优点：成分已知，便于对实验条件进行控制

7、。 缺点：无法替代一些未知成分。 解决途径：合成培养基中添加小牛血清，彼此互补。意味着合成培养基都是无血清培养基。 目前常用的合成培养基：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等. MEMMEM培养基：培养基：厄尔利（Earle）于1951年开发成功。含有少量氨基酸、维生素、谷氨酰胺以及必须的无机盐，组成简单。 DMEMDMEM培养基：培养基：由杜尔贝科（Dulbecco）等在MEM培养基基础上研制而成，增加了各已有成分的含量，同时又根据葡萄糖高低分为高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L）。（3 3）无血清培养基）无血清培养基血清培养基的优点：含有丰富的利于细

8、胞生长的成分血清培养基缺点：（1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用。（2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过程不易检测控制。（3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养产物的分离、提纯以及检测造成一定困难。无血清培养基无血清培养基(Serum free medium,SFM)是不含血清的动物细胞培养基，由基础培养基和添加组分组成。基础培养基较常用的是DMEM、F12培养基。添加组分主要包括：细胞外基质、生长因子、结合蛋白与转运蛋白、酶抑制剂等。动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件3、其他溶液（1 1）平衡盐溶液（）平衡盐溶液（Balanced salt solutionBalance

9、d salt solution，BSSBSS） 主要由无机盐组成，具有维持细胞渗透压、调控培养液酸、碱度平衡的功能。 例如：HanksHanks液，液，注：酚红酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。（2 2）培养基）培养基pHpH调整液调整液 大部分合成培养液都呈微酸性。常用pH调整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。 HEPESHEPES是一种非离子两性缓冲液，其在pH 7.2 - 7.4范围内具有较好的缓冲能力。中文名：4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸。（3 3）细胞消化液）细胞消化液 从组织块消化分散得到单个细胞 传代培

10、养时分散细胞 代表：胰蛋白酶溶液，水解细胞间的蛋白质，加血清终止反应。 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）消化液：解离细胞,两者常结合使用，增加效果。（4 4）抗生素溶液）抗生素溶液 防止微生物污染。 常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等。动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件4、培养条件 影响动物细胞体外生长的因素包括生物因素、化学因素、物理因素。生长条件的控制主要包括温度、pH、渗透压、气体等。 温度：温度：人类和哺乳类动物细胞培养适宜温度为36.55。 pHpH：哺乳动物细胞的培养pH值范围为7.1-7.3。 渗透压：渗透压：细胞在高渗透压或低渗透压溶液中会发生皱缩或肿胀，甚至破裂。

11、BSS溶液。 气体：气体：细胞的生长代谢离不开气体，主要包括O2和CO2，二氧化碳培养箱很重要。动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件5、培养工具 1923年卡雷尔（Carrel）（法国医学家、生物学家，1912年诺贝尔生理医学奖）设计了用于动物细胞培养的卡式培养瓶卡式培养瓶，培养鸡胚心肌组织获得成功。 培养瓶的形状主要是适合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。培养瓶主要有高硼硅玻璃培养瓶高硼硅玻璃培养瓶与聚苯乙烯塑料培养瓶聚苯乙烯塑料培养瓶。动物细胞培养方式动物细胞培养方式动物细胞培养可以分为贴壁培养、固定化培养、悬浮培养贴壁培养、固定化培养、悬浮培养三大类。1 1、贴壁培养：、贴壁培养：细胞

12、贴附在一定的固相表面进行的培养。 优点优点：容易更换培养液；容易采用灌注式培养灌注式培养、不需过滤系统；同一设备可采用不同的培养液培养液、适用于所有类型细胞。 缺点缺点：扩大培养比较困难、投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长。（1 1）贴壁材料）贴壁材料 要求：具有亲水性、正电荷。 常用材料：硅硼酸玻璃（卡氏培养瓶等）、聚苯乙烯（96孔培养板等） 对微载体而言还要求具一定三维结构。动物细胞培养方式动物细胞培养方式（2 2）贴附生长过程）贴附生长过程 游离期：游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。 吸附期：吸附期：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数细胞都可在24小时内贴壁。 繁殖期：繁

13、殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着细胞数量的增多，细胞间开始接触接触并连接成片。出现接触性抑制。 退化期：退化期：细胞长满培养瓶壁，随着营养物的消耗和代谢物的积累，密度抑制密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不及时传代培养，细胞会从瓶壁上脱落死亡。细胞贴壁过程动物细胞培养方式动物细胞培养方式2 2、固定化培养、固定化培养 可以采用类似植物细胞固定化培养的方法对动物细胞进行固定化培养。 具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。固定化方法与植物细胞类似。3 3、悬浮培养、悬浮培养 细胞在反应器中自由悬浮生长。 主要用于非贴壁依赖型细胞培养

14、非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞、血液白细胞、淋巴细胞，某些肿瘤细胞等属于此类细胞。 贴壁型细胞贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。动物细胞小规模培养动物细胞小规模培养1、培养瓶培养法 1923年，卡雷尔（Carrel）设计成功卡氏瓶，可以保证动物细胞培养的无菌环境和生长空间。 培养瓶培养法是目前动物细胞小规模培养的主要方法之一。动物细胞小规模培养动物细胞小规模培养2、培养板培养法（微量培养法）现代体外培养技术最为常用的方法之一。基本要点：将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。常用的培养板有6孔、24孔、96孔培养板。动物细胞小规

15、模培养动物细胞小规模培养3、灌注小室培养法1912年由伯罗设计了一种简单的灌注小室培养模型。基本要点：将细胞接种于一个由上下两个盖玻片（分别构成上壁与下壁）与一金属圈（构成侧壁）密封围成的小室内，保持在一定条件下培养。在小室的侧面分别有液体流入和流出的开口，供新鲜培养液流入和旧培养液排出。显著特点：营养液可以循环供应动物细胞小规模培养动物细胞小规模培养4、转管培养法1933-1934年，盖尔（Gey）和刘易斯（Lewis）建立了旋转管培养方法，将培养物接种于一管状培养器皿中，再将其固定在一可以旋转的装置上旋转培养。旋转管培养方法克服了静置培养的不足，例如：细胞生长环境不均匀、不利于营养的吸收等

16、，培养物可以交替地接触培养液和气体环境，利于细胞或组织生长。动物细胞原代培养动物细胞原代培养 接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单个细胞再进行培养，在首次传代前的培养称为原代培养（Primary culture）。 一般持续1-4周。在这个阶段，细胞有分裂但不旺盛。细胞多呈二倍体核型，这样的细胞称为原代细胞（Primary cell）。 优点：1、组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内的形态学特征。2、在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，原代细胞是很好的实验材料，例如药物测试、研究细胞分化等。1 1、组织块原代培养、组织块原代培养 组织块原代培养是比较常

17、用的简易的原代培养方法，也是早期动物细胞培养方法。以培养瓶培养为例：（1）剪刀剪碎组织形成1mm2的组织块，用吸管吸出组织块一一放入培养瓶内，一般每小块间隔为0.2-0.5厘米，使其均匀贴在培养瓶的壁上。（2）然后将贴有组织块的瓶壁朝上，加入培养液，塞上瓶塞，倾斜置于37的CO2培养箱内培养2-4小时后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养。24小时后补充培养液，一般3-5天更换培养液。（3）一般情况下，组织块贴壁后24小时细胞就从组织块四周长出，5-7天组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落，组织块四周的贴壁细胞也逐渐形成层片。2 2、细胞原代培养、细胞原代培养 酶解制备单细胞：根据不同的组织对象采用适

18、当的酶消化液获得动物细胞进行培养。 胚胎等组织细胞潜伏期短，第二天既可见生长，一周便可接连成片；成体组织来源的细胞潜伏期长，一般要一周左右。 最常用的酶解液有胰蛋白酶和胶原酶，链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。EDTA适合消化传代细胞，常与胰蛋白酶一起使用。热消化热消化冷消化冷消化动物细胞传代培养动物细胞传代培养 传代培养传代培养（Passage culture/Subculturing）是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细胞的体外大量增殖以及细胞系的建立是通过传代培养实现的。 注意：每进行一次分离再培养称为传一代。这里的传代代数与细胞代数或倍增不同，“一代”是指从细

19、胞接种培养到分离再培养期间的一段时间。在细胞一代中，细胞约能倍增36次。 悬浮生长悬浮生长的细胞可以采用加入新鲜培养基后直接吹打分散传代，或者采用离心或沉降法加入新鲜培养基后再吹打分散进行传代。 贴壁生长贴壁生长的细胞需要进行细胞分离重新接种培养。一般采用酶消化法进行传代培养。传代培养方法传代培养方法1 1、吸出或者倒掉培养瓶内的旧培养液。、吸出或者倒掉培养瓶内的旧培养液。2 2、加入胰蛋白酶和、加入胰蛋白酶和EDTAEDTA混合液盖满瓶底，轻轻摇动培养瓶。混合液盖满瓶底，轻轻摇动培养瓶。3 3、2-52-5分钟后检查，有细胞间隙变大、细胞质回缩现象时添分钟后检查，有细胞间隙变大、细胞质回缩现

20、象时添加培养液终止消化。加培养液终止消化。4 4、吸出消化液，加入、吸出消化液，加入HanksHanks液轻轻转动，洗去残留消化液。液轻轻转动，洗去残留消化液。5 5、加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液。、加入培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液。6 6、计数，接种进行传代培养。、计数，接种进行传代培养。酶消化法动物细胞培养的一般过程动物细胞培养的一般过程 动物细胞体外培养一般经过：1、组织获得与消化组织获得与消化2、接种接种3、原代培养原代培养4、传代培养传代培养细胞培养过程分析与监测细胞培养过程分析与监测1 1、细胞形态检查及活力分析、细胞形态检查及活力分析：倒置

21、显微镜下观察；四唑盐（MTT）法可以对细胞活力进行分析（活细胞的线粒体脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色蓝紫色产物甲暨j并沉淀在细胞中）。2 2、pHpH及污染检查及污染检查：含血清的新鲜培养液呈桃红色，pH在7.27.4之间。CO2的积累使培养液pH下降。当超出缓冲范围时，培养液变黄，需34天更换一次培养液。CO2培养箱能自动控制5%的CO2含量。细菌污染时培养液变浑浊；支原体易透过滤器，污染不易被发现。细胞系与细胞株细胞系与细胞株 1.细胞系(Cell line)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种一种细胞细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。第一次传代培养后的细胞即称之

22、为细胞系。不能连续培养的为有限细胞系有限细胞系(Finite cell line)，能连续培养下去的为连续细胞系连续细胞系(Infinite cell line)。 2.细胞株(Cell strain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细单细胞分离培养或通过筛选胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。靶细胞的分离纯化靶细胞的分离纯化 靶细胞的分离纯化方法分为自然纯化和人工纯化。1、自然纯化是多次传代过程中，利用混合系中某一种细胞的增殖优势不断排挤其他类型细胞而最终被纯化的方法。此方法费时费力

23、，选择纯化的细胞具有盲目性。2、人工纯化根据某一类型的细胞生长条件，抑制其他细胞生长，从而达到纯化的目的。（1）细胞因子依赖法：利用靶细胞对特殊细胞因子的需求与其他细胞分离。（2）反复贴壁法：利用不同细胞贴壁速度快慢的差异进行分离。（3）酶消化法：利用不同细胞对消化酶的耐受性差异进行分离。（4）机械法：硅胶软刷刮除非靶细胞。细胞株的纯化细胞株的纯化 细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细胞，并进行体外繁殖成为新的细胞群体。1、毛细管法：通过无限稀释法将细胞稀释成1个细胞/ml，然后在显微镜下用毛细管将细胞分离出来单独培养形成单克隆细胞群体。2、有限稀释法：将细胞悬液梯度稀释后接种到96孔板

24、，进行一定时间的培养，理论上某一个孔中会有单克隆细胞群体。适合工业化生产的细胞株适合工业化生产的细胞株原代细胞传代细胞二倍体细胞异倍体细胞融合细胞转化细胞基因工程细胞有限系细胞无限系细胞永生细胞正常细胞转化细胞转化细胞转化细胞是指细胞发生遗传改变遗传改变而产生永生永生化，即由有限性细胞系转化为无限性细胞系，可以在体外进行无限传代无限传代和生长繁殖。转化细胞方法：转化细胞方法：1.1.细胞自转化细胞自转化体外培养的细胞自发出现的转化现象。这种现象在许多正常二倍体长期传代过程中出现。可能的因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污染等。2.2.人工诱发转化人工诱发转化采用诱导剂使正常细胞发生转化

25、。凡是可以改变DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、物理和病毒诱导剂。常用细胞株常用细胞株n CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)：中国仓鼠卵巢仓鼠卵巢细胞，亚二倍体亚二倍体(2n-1)(2n-1)，有多种突变株。贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压改变有较高的忍受能力。CHO细胞能表达糖基化蛋糖基化蛋白药物白药物：组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、促红细胞生成素（EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、粒细胞集落刺激因子（GCSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。常用细胞株常用细胞株n VeroVero细胞细胞（Vero cell）:是19

26、62年日本从非洲绿猴肾绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体异倍体，贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞之一。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。常用细胞株常用细胞株n 293T293T细胞细胞（293t cell）: 293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒（Ad 5）DNA的永生化细胞。此细胞室温不贴壁，37几日后重新贴壁。动物细胞大规模培养动物细胞大规模培养n 动物细胞大规模培养：在人工条件下（动物细胞大规模培养：在人工条件下（pHpH值、氧气、二氧化碳、值、氧气、二氧化碳、营养、温度等）进行高密度大量增殖细胞的技术。营养、

27、温度等）进行高密度大量增殖细胞的技术。n 培养流程：组织培养流程：组织-消化消化-原代培养原代培养-传代培养（细胞系传代培养（细胞系和细胞株）和细胞株）-小规模培养（培小规模培养（培养瓶、培养皿）养瓶、培养皿）-代谢产物代谢产物（分离、纯化）（分离、纯化）1 1、转管、转管/ /瓶培养系统瓶培养系统p转瓶培养是在转管培养基础上为扩大培养量而改进的。p转瓶或转管固定在旋转支架上，倾斜角度一般为5-10。p细胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋转而流动，细胞交替接触营养和空气，利于细胞吸收营养、进行气体交换。2 2、微载体培养系统、微载体培养系统p微载体培养是将传统的一维平面贴附扩展为三维立体贴

28、附，增加了贴壁细胞的贴壁面积，有利于贴壁细胞的大规模工业化培养。p微载体指直径60-250m，能适用于贴壁细胞生长的微珠。p微载体一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。显微镜下的高密度微载体显微镜下的高密度微载体优良的微载体应具有的特性优良的微载体应具有的特性p 不含不含能能毒害毒害细胞细胞的的成分成分；p 微载体须微载体须与细胞有良好的相容性，一般带正电荷与细胞有良好的相容性，一般带正电荷；p 密度密度应应略大于培养基略大于培养基；p 粒径粒径在在4040120120 mm范围，生理盐水溶胀后增大到范围，生理盐水溶胀后增大到60250 60250 mm，粒度分布地均匀，径差不大于粒度分

29、布地均匀，径差不大于20252025 mm；p 良好的良好的光学透明性光学透明性；p 能在能在PBSPBS中中耐耐120125120125、2030min2030min高温灭菌高温灭菌；p 应是应是非刚性材料非刚性材料；p 不吸收不吸收培养基中的培养基中的营养成分营养成分；p 收获收获细胞或细胞制品细胞或细胞制品容易容易，不影响蛋白质分离纯化不影响蛋白质分离纯化；p 价廉价廉，能，能重复重复使用。使用。微载体的类型微载体的类型目前市售（国际）种类有十几种以上：市售（国际）种类有十几种以上：大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性

30、微载体等。常用的微载体主要是固体微载体，包括实心微载体和多孔微载体。实心微载体：细胞能贴附在微载体表面生长。实心微载体：细胞能贴附在微载体表面生长。多孔微载体：微载体内部具有网状结构的小孔，细胞在微载体的内多孔微载体：微载体内部具有网状结构的小孔，细胞在微载体的内部生长。部生长。微载体培养原理微载体培养原理将对细胞无害的颗粒（微载体）加入到培养容器的培养液中，作为将对细胞无害的颗粒（微载体）加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。始终保持悬浮状态。丝网丝网微载体微载体通气

31、的培养基通气的培养基鼓泡器鼓泡器搅拌叶轮搅拌叶轮微载体培养装置图微载体培养装置图p细胞细胞增殖阶段：增殖阶段：黏附贴壁、生长和黏附贴壁、生长和扩展成单层；扩展成单层；p贴附是进一步铺展和生长的关键，贴附是进一步铺展和生长的关键，主要是靠静电引力和范德华力；主要是靠静电引力和范德华力；p细胞能否黏附，主要取决于细胞与细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的微载体的接触概率和相融性接触概率和相融性。Vero细胞在Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化a.a.初期呈半球形，细胞轮廓清晰，球形饱满（接种后初期呈半球形，细胞轮廓清晰，球形饱满（接种后2020分钟）；分钟）；b.b.粘得不牢固，粘得

32、不牢固，容易洗掉，留下痕迹（接种后容易洗掉，留下痕迹（接种后3030分钟）；分钟）；c.c.细胞开始铺展，半球形变成扁平，轮细胞开始铺展，半球形变成扁平，轮廓模糊，边缘开始出现掕角（接种后廓模糊，边缘开始出现掕角（接种后6060分钟）；分钟）；d.d.细胞变成多边形或纺锤形，伸细胞变成多边形或纺锤形，伸出伪足（接种后出伪足（接种后120120分钟）；分钟）；e.e.细胞迁移，寻找合适生存位置，留下尾迹；细胞迁移，寻找合适生存位置，留下尾迹；f.f.细细胞膜与基质表面受力点不连续，接触面有间隙。胞膜与基质表面受力点不连续，接触面有间隙。微载体培养操作过程微载体培养操作过程(1)(1)选择合适的微

33、载体类型选择合适的微载体类型(2)(2)浸泡水化及消毒浸泡水化及消毒(3)(3)接种接种 (4)(4)培养观察与细胞记数培养观察与细胞记数 (5)(5)消化与传代消化与传代(6)(6)收获收获交联葡聚糖交联葡聚糖纤维素为基质微载体纤维素为基质微载体蛋白质为基质微载体（变性胶原微载体蛋白质为基质微载体（变性胶原微载体: :蛋黄色，表面特性好，蛋黄色，表面特性好，易与细胞结合）易与细胞结合）高分子材料为基质微载体高分子材料为基质微载体无机玻璃基质微载体无机玻璃基质微载体 (1)(1)选择合适的微载体类型选择合适的微载体类型对细胞在不同微载体上的贴附性能进行评价，计算细胞贴壁率和细胞数，绘制成曲线，

34、比较细胞容纳量、微载体用量、搅动速度，从而选择合适的微载体。不同种类聚酯的微球表面形貌差异不同种类聚酯的微球表面形貌差异A：PCL微球表面多皱B：PLLA微球表面布满坑洞C：PGLA微球表面光滑(2)(2)浸泡水化及消毒浸泡水化及消毒加入无钙离子和镁离子的PBS缓冲液浸泡3h以上，轻轻搅动，重复一次，高压灭菌处理。( (3 3) )接种接种不同细胞种类接种细胞浓度不同，目的是保证培养基与微载体处于稳定的pH值和温度水平，通常接种对数生长期细胞。( (4 4) )培养观察与细胞记数培养观察与细胞记数 观察的目的是确定培养基中细胞增殖的情况，细胞数量越多，微载体表面的细胞越多，微载体越重，此时需要提高搅拌速度，防止微载体沉淀。(5)(5)消化与传代消化与传代消化酶的选择，消化剂量，消化时间，终止消化的方法等。微载体分离下来的细胞可进