高中生物选修1专题5DNA和蛋白质技术2

1、课题课题1 DNA1 DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一一. .基础知识基础知识DNADNA粗提取的基本思路：粗提取的基本思路：利用利用DNADNA与与RNARNA、蛋白质和脂、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的质等在物理和化学性质方面的差异差异，提取，提取DNADNA，去除，去除其他成分。其他成分。1.1.提取生物大分子的基本思路：提取生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。学性质的生物大分子。2.DNA2.DNA的理化特性的理化特性1)DNA1)DNA的溶解性的溶解性在在NaClNaCl溶液浓度在

2、溶液浓度在0.14 mol/L0.14 mol/L时时,DNA,DNA溶解度溶解度最小最小；低于低于( (或高于或高于)0.14 mol/L)0.14 mol/L时，时，DNADNA的溶解度随的溶解度随NaClNaCl溶溶液浓度的降低液浓度的降低( (或增加或增加) )而逐渐增大。而逐渐增大。DNADNA的的不溶于不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精酒精，某些蛋白质溶于酒精2)DNA2)DNA的其它特性的其它特性蛋白酶能水解蛋白质，但是对蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNADNA没有影响没有影响大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60608080的高温，而的高温，而DNADNA在在8080以上才会变

3、性以上才会变性洗涤剂洗涤剂可以可以瓦解瓦解细胞的细胞的细胞膜细胞膜，但对，但对DNADNA没有影响没有影响3.DNA3.DNA的鉴定原理的鉴定原理1)DNA 1)DNA 二苯胺二苯胺试剂试剂沸水浴沸水浴溶液变溶液变蓝色蓝色2)DNA2)DNA可被可被甲基绿甲基绿染成染成绿色绿色一一) )实验原理实验原理二二. .实验设计实验设计1.1.破碎细胞，释放核物质破碎细胞，释放核物质动物细胞动物细胞 加加蒸馏水蒸馏水让细胞吸水让细胞吸水胀破胀破, ,过滤得滤液过滤得滤液植物细胞植物细胞 加洗涤剂和食盐加洗涤剂和食盐, ,充分研磨充分研磨 蒸馏水对于鸡血细胞来说是蒸馏水对于鸡血细胞来说是低渗溶液低渗溶液

4、, ,水分可大量进水分可大量进入鸡血细胞入鸡血细胞, ,是细胞是细胞胀裂胀裂, ,从而从而释放释放DNADNA搅拌可搅拌可加速加速细胞破裂细胞破裂讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？二二) )实验材料的选取实验材料的选取选选DNADNA含量较高含量较高的生物组织作为材料的生物组织作为材料, ,成功可能性更大成功可能性更大材料：可选鱼卵、猪肝、鸡血材料：可选鱼卵、猪肝、鸡血2.2.除去杂质，分离出除去杂质，分离出DNADNA 用浓度为用浓度为2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶解溶液溶解DNA,DNA,逐渐加水稀释逐渐加水稀释, ,当降至

5、当降至0.14mol0.14molL L时时( (溶解度最低溶解度最低) )可以使可以使DNADNA析出析出向向DNADNA的盐溶液，逐渐加的盐溶液，逐渐加酒精酒精，可，可析出析出DNADNA三三) ) 实验步骤实验步骤1 1鸡血加入柠檬酸钠溶液液，是为了防止血液凝固。鸡血加入柠檬酸钠溶液液，是为了防止血液凝固。三三) ) 实验步骤实验步骤三三) ) 实验步骤实验步骤三三) ) 实验步骤实验步骤7.DNA7.DNA的鉴定：取两支试管，各加入的鉴定：取两支试管，各加入2ml0.0152ml0.015氯化钠溶氯化钠溶液，将液，将DNADNA溶解于其中一支试管中，另一支做为对照组。溶解于其中一支试管

6、中，另一支做为对照组。然后，在两支试管内加等量的二苯胺试剂，水浴加热然后，在两支试管内加等量的二苯胺试剂，水浴加热10min10min左右，冷却，观察实验现象。左右，冷却，观察实验现象。例例1.1.下列关于下列关于DNADNA的叙述正确的是的叙述正确的是( ( ）A.A.随着氯化钠溶液浓度增大，随着氯化钠溶液浓度增大，DNADNA在氯化钠溶液中的溶在氯化钠溶液中的溶解度也增大解度也增大B.B.随着氯化钠溶液浓度的减小，随着氯化钠溶液浓度的减小，DNADNA在氯化钠溶液中的在氯化钠溶液中的溶解度也减小溶解度也减小C.DNAC.DNA不溶于酒精，也不溶于不溶于酒精，也不溶于0.14mol/L0.1

7、4mol/L的氯化钠溶液的氯化钠溶液D.DNAD.DNA与二苯胺试剂在沸水中加热，溶液变蓝色与二苯胺试剂在沸水中加热，溶液变蓝色D D例例2.2.鸡血中含大量红细胞，实验室常用鸡血提取鸡血中含大量红细胞，实验室常用鸡血提取DNADNA。根据根据DNADNA提取实验，完成下列各题。提取实验，完成下列各题。1.1.为了防止鸡血凝血需加入的试剂是为了防止鸡血凝血需加入的试剂是 。2.2.将鸡血离心，取下层，除去上清的目的是将鸡血离心，取下层，除去上清的目的是3.3.向向DNADNA的氯化钠溶液缓缓加蒸馏水，直至析出的氯化钠溶液缓缓加蒸馏水，直至析出DNADNA不再不再增加，此时氯化钠溶液的浓度约为增

8、加，此时氯化钠溶液的浓度约为 . .柠檬酸钠柠檬酸钠去杂质去杂质0.14mol/L0.14mol/L4.4.若没鸡血，能否用牛羊血代替？为什么？若没鸡血，能否用牛羊血代替？为什么？5.5.若用菜花进行提取若用菜花进行提取, ,需加入需加入 , ,并充分研磨并充分研磨洗涤剂和洗涤剂和食盐食盐课题课题2 2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段（PCRPCR）一、基础知识一、基础知识一一)PCR)PCR原理原理 PCR PCR是一种在是一种在体外体外快速扩增快速扩增特定基因或特定基因或DNADNA片段片段的技术，它能以极少量的的技术，它能以极少量的DNADNA为模板，在几小时内

9、为模板，在几小时内复制出上百万份的复制出上百万份的DNADNA拷贝。拷贝。1.PCR1.PCR的反应条件的反应条件一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液-维持维持pHpH；DNADNA模板；模板；分别与两条模板链相结合的分别与两条模板链相结合的两种两种引物；引物；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸； 耐热的耐热的DNADNA聚合酶；聚合酶； 控制温度控制温度因此，因此，DNADNA复制方向：只能从子链的复制方向：只能从子链的55端到端到33端端延延伸伸2.DNA2.DNA复制的方向复制的方向 DNA DNA聚合酶聚合酶不能从头开始不能从头开始合成合成DNADNA，只能只能将将核苷酸连接到核苷酸连接到DNAD

10、NA片段的片段的33端端。引物引物 能与母链的一段碱基序列互补配对的一小段能与母链的一段碱基序列互补配对的一小段单链单链DNADNA片段或片段或RNARNA且需要且需要引物引物(20(203030个核苷酸个核苷酸) )PCRPCR技术通过技术通过控制温度控制温度来控制双链的解旋与结合来控制双链的解旋与结合 DNA DNA在在8080100100时双螺旋结构将解体时双螺旋结构将解体, ,双链分开双链分开; ;当当温度降低温度降低后双链又能重新结合成双螺旋结构后双链又能重新结合成双螺旋结构因此因此,PCR,PCR过程过程无需无需解旋酶解旋酶, ,但需但需耐高温耐高温的的DNADNA聚合酶聚合酶3.

11、DNA3.DNA的热变性原理的热变性原理二二)PCR)PCR的反应过程的反应过程1.1.变性：变性：2.2.复性：复性：3.3.延伸：延伸：循环循环升高温度到升高温度到90900 0C C以上以上DNADNA解聚为单链解聚为单链温度降到温度降到50500 0C C左右左右两种引物与两条单链两种引物与两条单链DNADNA结合结合升温度升到升温度升到70700 0C C左右左右在在DNADNA聚合酶的作用下用溶液中的脱氧核苷酸聚合酶的作用下用溶液中的脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新根据碱基互补配对原则合成新DNADNA链链一一) )实验操作步骤实验操作步骤准备好准备好PCRPCR反应体系的配方

12、反应体系的配方用微量移液器按配方在往微量用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液离心离心10S10S将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上仪上, ,设置设置好循环程序进行反应好循环程序进行反应二、实验操作二、实验操作二二) )操作提示操作提示PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的污等因素的污染而造成干扰实验，染而造成干扰实验，PCRPCR操作时要注意做到：操作时要注意做到：隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲

13、液以及蒸馏水等在使用必须进行以及蒸馏水等在使用必须进行高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌；所用试剂在所用试剂在-20-20保存保存，使用时，放在，使用时，放在冰块冰块上上慢慢融化。慢慢融化。分装试剂，简化操作程序，使用分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。一次性枪头。1 1 、测定的、测定的原理原理 可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与峰值的大小与DNADNA的含量有关。的含量有关。2 2 、过程过程稀释：稀释：2uLPCR2uLPCR反应液，加入反应

14、液，加入98uL98uL蒸馏水，即将样蒸馏水，即将样品进行品进行5050倍稀释。倍稀释。对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，处，将紫外分光光度计的读数调节至零。将紫外分光光度计的读数调节至零。取取DNADNA稀释液稀释液100uL100uL至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处处的光吸收值的光吸收值比色比色计算计算DNADNA含量含量( ( g/mLg/mL) )50 x(260nm50 x(260nm的读数的读数)x )x 稀释倍数稀释倍数5050：1 1 g g/mL/mL的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1c

15、m比色杯中的吸光值为比色杯中的吸光值为0.020.02课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离基础知识基础知识一一) )凝胶色谱法凝胶色谱法 根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小，的大小，来进行分离。来进行分离。1.1.概念：概念：思路思路利用不同蛋白质分子的特性利用不同蛋白质分子的特性( (形状、大小、形状、大小、带电情况等带电情况等) )差异，分离不同种类的蛋白质差异，分离不同种类的蛋白质课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离基础知识基础知识一一) )凝胶色谱法凝

16、胶色谱法2.2.原理：原理： 2 2）当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量子量较小较小的蛋白质容易的蛋白质容易进入进入凝胶凝胶内部内部的通道，路程较的通道，路程较长长，移动速度较移动速度较慢慢; ;而相对分子量而相对分子量较大较大的蛋白质无法进入的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能凝胶内部的通道，只能在在凝胶凝胶外部外部移动，路程较移动，路程较短短，移，移动速度较动速度较快快。1)1)凝胶凝胶是由多糖类化合物是由多糖类化合物( (如葡聚糖如葡聚糖) )构成的构成的多孔小球体多孔小球体，内部有许多贯穿的，内部有许多贯穿的通道通道。课题课题3 3

17、 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离基础知识基础知识二二) )缓冲液缓冲液 在在一定一定的范围内，凡是能够的范围内，凡是能够抵制抵制外加少量强外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液酸或强碱的影响使原来溶液PHPH值值基本保持不变基本保持不变的混的混合溶液。合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离实验操作实验操作 蛋白质的提取和分离步骤：蛋白质的提取和分离步骤：1.1.样品处理样品处理 2.2.粗分离粗分离 3.3.纯化纯化 4.4.纯度鉴定纯度鉴定 课

18、题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离实验操作实验操作1.1.样品处理样品处理: : 1)1)红细胞的红细胞的洗涤洗涤: :目的目的: :去除杂蛋白去除杂蛋白b b低速短时间离心低速短时间离心操作操作: :a a采集血样采集血样d d盐水洗涤盐水洗涤c c吸取血浆吸取血浆上层透明的黄色血浆上层透明的黄色血浆重复重复b c db c d步骤三次步骤三次用五倍体积的质量分数为用五倍体积的质量分数为0.90.9的的NaClNaCl溶液洗涤溶液洗涤加抗凝剂柠檬酸钠加抗凝剂柠檬酸钠课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离实验操作实验操作1.1.样品处理样品处理: : 2)

19、2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积加蒸馏水到原血液体积, ,再加再加4040体积的甲苯体积的甲苯, ,置于磁力搅拌器上充分搅拌置于磁力搅拌器上充分搅拌1010分钟分钟( (加速细胞破裂加速细胞破裂) )细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离实验操作实验操作1.1.样品处理样品处理: : 离心离心( (以以2000r/min,10 min)2000r/min,10 min)过滤过滤( (用滤纸用滤纸, ,除去脂溶性沉淀层除去脂溶性沉淀层) )分离分离( (用分液漏斗用分液漏斗, ,分出下层的分出下层的红色透

20、明液体红色透明液体) )课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离实验操作实验操作2.2.粗分离透析粗分离透析除去样品中分子量除去样品中分子量较小较小的杂质的杂质利用透析袋的利用透析袋的半透性半透性某些杂质分子比血红蛋白分子某些杂质分子比血红蛋白分子小小，可透过可透过透析袋透析袋课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离实验操作实验操作3.3.纯化纯化 玻璃管玻璃管底塞的制作底塞的制作顶塞的制作顶塞的制作组装组装安装其他附属结构安装其他附属结构用用凝胶色谱法凝胶色谱法将将分子量较大分子量较大的杂质蛋白质除去的杂质蛋白质除去课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白

21、的提取和分离实验操作实验操作3.3.纯化纯化 2)2)凝胶色谱柱的凝胶色谱柱的装填装填注意注意:a:a凝胶装填时尽量紧密凝胶装填时尽量紧密, ,以降低凝胶颗粒之间的空隙以降低凝胶颗粒之间的空隙 b b装填凝胶柱时不得有气泡存在装填凝胶柱时不得有气泡存在课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离实验操作实验操作3.3.纯化纯化 2)2)凝胶色谱柱的凝胶色谱柱的装填装填凝胶的选择凝胶的选择凝胶的前处理凝胶的前处理凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装填方法注意注意:a:a凝胶装填时尽量紧密凝胶装填时尽量紧密, ,以降低凝胶颗粒之间的空隙以降低凝胶颗粒之间的空隙 b b装填凝胶柱时不得有气

22、泡存在装填凝胶柱时不得有气泡存在洗涤平衡洗涤平衡a a液面不要低于凝胶表面，液面不要低于凝胶表面， b b不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 1.调液面调液面 2.加样加样 3.再调液面再调液面 4.洗脱洗脱 5.收集收集缓冲液缓冲液凝胶凝胶课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离实验操作实验操作3.3.纯化纯化 3)3)样品加入与洗脱样品加入与洗脱 注意：注意：a a不要触及并破坏凝胶面。不要触及并破坏凝胶面。b b贴壁加样。贴壁加样。 c c使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动。课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离实验操作实验操作4.4.纯度鉴定纯度鉴定 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳鉴定血红蛋白鉴定血红蛋白纯度纯度。略略课题课题3 3 血红蛋白的提取