土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望5[1]

1、土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望摘要: 土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分, 在土壤有机物质分解和养分释放、能量转移等中起着重要作用。随着人们对生物群落结构多样性重要性认识的不断深入及研究方法的不断改进, 土壤微生物群落结构多样性, 尤其是群落结构的研究工作逐渐受到生态学家的重视。本文从土壤微生物群落结构多样性的影响因素以及研究方法等方面阐述了目前国内外土壤微生物群落结构多样性的研究现状, 并对其未来研究方向进行了合理展望。关键词:微生物,群落结构, 土壤 微生物群落Review and prospects on methodology and affecting fact

2、ors of soil microbialcommunity structure Abstract: Soil microorganisms are important components of soil ecosystem and playcentral roles in biogeochemicalcycling such as organic matter decomposition, mineral nutrient release, and energy transformation. Along with the intensive comprehension of the im

3、portance of microbial community structure diversity and the rapid development of  methodology, more and more studies have focused on soil microbial community  structure diversity. This review introduces the current development of methodology and affecting factors of soil microbial communit

4、y structure diversity. We also discussed the directions of future research on soil microbial community structure diversity.Key words: biodiversity, community structure ; soil；microbial community 引言土壤微生物主要指土壤中那些个体微小的生物体,主要包括细菌、放线菌、真菌,还有一些原生动物和藻类等 1 。土壤微生物是影响土壤生态过程的一个重要因素, 土壤微生物在土壤形成、生态系统的生物地球化学循环、污染物

5、质的降解和维持地下水质量等方面都具有重要作用 2, 3, 4 。由于土壤中微生物个体微小, 数量多,土壤微生物分离和鉴定困难,土壤环境条件复杂等原因, 目前为止大约仅110%的土壤微生物被分离和鉴定,这些限制了对土壤微生物在陆地生态系统中重要作用的认识 5, 6 。虽然,对土壤微生物的认识有限,但这并没有影响它们在维护整个陆地生态系统稳定中的重要作用。近年来,随着研究的日益深入,对土壤微生物群落结构及其影响因素、土壤微生物结构与生态功能的关系,土壤微生物在维持土壤质量等方面的研究越来越受到土壤学家、生态学家和微生物学家的关注.许多研究已经证实，通过传统的分离方法鉴定的微生物只占环境微生物总数的

6、0.1% 10 %1, 2。传统的土壤微生物研究方法如分离计数法、显微镜法往往会过低估价土壤微生物的群落结构组成，虽然使用电子显微镜或荧光抗体染色法可以对土壤微生物形态多样性进行观察，但是这两种方法并不能描述出土壤微生物的群落结构组成方面的信息，也无法描绘出不同群体的生理差异。随着微生物研究技术的发展尤其是分子生物学技术的发展，土壤微生物学家开发出一系列的研究土壤微生物群落结构的方法。1土壤微生物多样性影响因素1.1土壤生态系统内生物因素对土壤微生物群落结构的影响1.1.1植物多样性对土壤微生物群落结构影响陆地生态系统中植物多样性是影响土壤微生物群落结构的另一个重要因素 26 。植物多样性对土

7、壤微生物群落结构的影响主要是两个方面:一方面是植物为土壤微生物提供营养物质,另一方面植物多样性影响整个生态系统的过程,进而间接的影响土壤微生物的群落结构 27, 28 。森林植物物种组成影响土壤微生物数量、群落结构及活性 29 。Bardgett 等发现栽种不同草本植物的土壤具有明显不同的土壤微生物磷脂酸图谱( PFLA) 31 。Grayston等利用B IOLOG系统研究发现长有不同草本植物的土壤具有不同的土壤微生物群落 32 。森林植被能影响林地微环境,通过根系分泌物、地上和地下凋落物以及树冠的拦截和淋洗作用改变土壤微生物生长所需能量物质的数量和质量 29,33 。陆地生态系统中植物通过

8、凋落物和地下根系分泌物为土壤中微生物提供营养物质。不同的植物凋落物理化性状不同,凋落物分解过程中释放的有机,无机物也不同,从而对土壤中微生物生长具有选择性刺激作用。另外,不同植物的根系分泌物也有很大差异,很早的研究就发现活的根系能分泌种类繁多的可溶性有机物质,包括糖、氨基酸和有机酸等,这些分泌物质为土壤生物提供C源引起根际微生物的快速生长,一般由活根分泌的可溶性有机物质通常在1 10g/100g根干重 28 。随着研究手段的进步发现根际中的真菌微生物比以前认识要丰富得多 34 。植物多样性对土壤微生物群落结构的影响具有几个特点: ( i)植物对土壤微生物特别是根际土壤微生物群落组成有选择性影响

9、( ii)这种选择影响的强度随植物不同而有差异( iii) ,这种选择性影响具有植物特异性 10 。植物的这种特异性在菌根菌和Frankia菌等与植物具有共生关系的微生物中表现的更加明显。1.1.2土壤微生物间相互作用土壤微生物之间存在复杂的关系,包括共生,互生,捕食等. 土壤微生物之间相互作用维持着整个土壤生态系统内土壤微生物群落结构的稳定。在森林生态系统中不同土壤微生物相互作用共同完成对凋落物的分解,推动整个系统的物质循环、能量流动。此外,在土壤中存在着大量的有益菌群,目前研究较多的是根际促生菌( PGPR) ,它们能维持土壤质量的健康,减少土壤中病源微生物的生长。土壤微生物之间具有一定的

10、拮抗作用。土壤中细菌产生的挥发性物质能影响其它土壤微生物的生长,直接影响了土壤微生物的群落结构。细菌的挥发物质影响真菌的生长和酶的活性,这种作用受细菌种类、年龄、环境因素的影响,并且真菌对不同细菌的产物具有特异性 16 。土壤微生物之间更多的是半共生关系,即“一种生态依赖关系,一种生物体改变周围的环境,为其后来的另一种生物体的生长创造条件” 23 。在植物凋落物分解过程中不同土壤微生物相互协作共同完成对凋落物的分解,分解过程中微生物具有一个演变的过程. 通常,真菌在凋落物分解过程初期占主要地位,分解凋落物中新鲜物质,而细菌在分解后期占主要地位完成凋落物的最终分解和矿化过程 24 。1.1.3土

11、壤动物多样性对土壤微生物活性与群落结构影响    土壤动物对土壤微生物群落结构的影响主要包括以下3个方面: (1)土壤动物的粉碎、搅拌、混合作用。土壤动物通过这些作用使进入土壤的凋落物等物质充分的与土壤混合,增加了土壤微生物与这些物质的接触机会。土壤动物消化植物残体后通过粪便排出体外,改变了这些物质的化学成分,大小等理化性状,导致了土壤微环境的改变。改变了土壤中细菌,真菌等不同微生物类群的竞争能力,引起土壤微生物群落结构的改变 25 。(2)土壤动物的选择性捕食作用。土壤中的原生动物主要以细菌和酵母菌为食物,最适合的食物来源是一些假单胞菌( Pseudom ona

12、daceae)和肠细菌( En terobacteriaeae ) , 酵母菌中的可勒克氏酵母(Kloeckera) 、红酵母( Rhodotorula ) 而有些细菌,放线菌,真菌能产生对原生动物有毒害作用的细胞外物质 25 。(3)土壤动物的传播作用。土壤动物对土壤微生物体或孢子的散布有作用,特别是在地表下,在干燥条件下,这时风和水对孢子的散步作用相对小。土壤动物的传播作用主要通过体表,口腔,粪便等途径。1.2土壤理化性状对土壤微生物群落结构的影响1.2.1土壤物理性状壤颗粒大小不同的颗粒等级的土壤其中的土壤微生物差异很大,粘粒部分土壤微生物多样性较高,细菌数量多,主要通过减少土壤微生物被

13、土壤动物捕食的机会,增加微生物获得营养的机会,增加土壤环境的多样性如降低氧气浓度为厌氧菌提供生长条件等,相反在较大颗粒的土壤中真菌数量相对增加。土壤微生物群落结构由于土壤颗粒大小的不同而差异很大 13 。水分水分保持能力极大影响了孔隙中的氧气条件, 进而影响了相关土壤中微生物的活性 14 。Cook等( 1970 ) 就注意到土壤中细菌在高的水势(waterpotential)情况下活性高,而真菌,放线菌在相对低的水势情况下活性较高 15 。在森林立地条件中土壤湿度是土壤微生物和土壤动物的一个重要控制因素 16 。Joshua (1999)等研究了桦树凋落物分解过程中湿度对微生物活性和群落结构

14、的影响,发现长时间干燥导致微生物呼吸和生物量降低,微生物群落结构变化,特别是潮湿和干燥的时间长度对土壤微生物影响很大 17 。土壤温度通常每种微生物都有自己的最适生长温度。微生物生长速率随温度升高而加快,当达到最适生长温度后再升高温度,反而使微生物生长变慢,而且不同的微生物种类生长的最适温度不同,所以,由于土壤温度的差别,土壤微生物群落结构组成也不同,并且随温度变化而改变。土壤温度变化导致土壤中微生物群落结构发生改变,原因可能是某些微生物群落成员在较高的温度时有能力代谢那些在较低温度时不能被利用的基质 18 。不同的气候条件下,由不同母岩发育而来的土壤其类型不同,决定了土壤颗粒组成、湿度、温度

15、、pH值等理化性状的不同。因此,不同土壤类型的中的微生物区系多样性及组成的差别很大。Martina S. Girvan等(2003)用B IOLOG方法, rDNA - DGGE和16S rRNA多种方法对不同管理条件下土壤微生物群落结构及变化规律进行研究,发现所用研究的样地明显分为两组,其土壤微生物群落结构的显著差异是由于土壤类型决定的,而不同有机物管理对土壤微生物群落结构影响不大。这是因为不同类型的土壤其物理、化学性状差异较大,而对于同一类型土壤来说由于土壤具有一定的缓冲能力所以土地不同经营措施对土壤微生物群落结构的短期影响较小。但是长期作用下,管理措施对土壤微生物影响可能更大,这些有待进

16、一步研究 20 。1.2.2土壤化学性状土壤中的微生物除了受土壤物理性状的影响外,更主要的是受到土壤中微生物可利用营养物质的影响。土壤中营养物质主要来源于地上植被的凋落物,植物根系分泌物,根的残体,此外还有土壤动物死后残体等,它们可以为微生物提供基本的碳源、氮源等物质 21 。壤C、N元素土壤微生物群落结构受土壤C元素影响比较大,随着土壤中可利用C含量的减少土壤微生物数量降低, 微生物群落结构改变 4 。Griffiths等(1999)研究发现向土壤中施加含C量高的物质能提高土壤微生物群落中真菌和戈兰氏阴性细菌的比例, 降低放线菌和戈兰氏阳性菌的比例 22 。Noath F. 等(2003)研

17、究土壤微生物在土壤不同层面的分布得到同样的结论,虽土壤层面加深土壤中微生物数量减少,其中真菌和戈兰氏阴性细菌的比例减少,而放线菌和戈兰氏阳性菌的比例增加 4 。土壤的N元素是土壤微生物生长的又一个限制因素,土壤中的N元素被微生物吸收利用后,在体内用于合成具有重要生理作用的蛋白质、核苷酸等生物大分子. 因此,土壤中N元素不足将严重限制土壤微生物的正常生长和活性。土壤微生物对土壤N源利用能力也有差别,通常N源易利用大小顺序为,铵态氮>硝态氮>有机氮。此外,不同土壤微生物利用N源能力也不同,这就使得土壤中N源的多少和种类将影响到土壤微生物的群落结构。土壤中可被土壤微生物利用营养的碳氮(C

18、 /N)比是表征土壤微生物生长是受C限制或是N限制的重要指标,影响到土壤微生物的群落结构。当C /N比等于或大于30: 1时土壤微生物生长受到N源限制,当C /N比等于或小于20: 1时土壤微生物的生长受到C源限制。一般, C /N比在25: 1时对土壤微生物生长最有利,也有利于维持土壤微生物在自然生态系统中的正常功能。壤pH值因素土壤pH值对于土壤中的微生物群落结构影响是相当复杂的,因pH对于营养的利用、微生物吸附、胞外酶的产生和分泌都会产生不同的影响。不同微生物适合生长pH值也有差别,细菌、放线菌适宜生长在微碱性的条件下,而真菌适合生长在酸性条件,在大多数酸性土壤中( pH 值低于5) ,

19、真菌数量相对较多,因此在这些土壤中,真菌所起的作用也比较大。除了土壤碳氮元素和pH因素外,土壤中的其它营养元素,如磷、硫等也影响土壤微生物生长和群落结构。另外,土壤中一些Ca、Mg、Mn、Fe等微量金属元素,也影响土壤微生物生长。1.3不同经营措施对微生物群落结构的影响1.3.1外施农药、化肥等措施农药等杀虫剂作为一种外施入土壤生态系统的物质,它和土壤中其它物质一样能被土壤中的微生物或其分泌的酶降解,从而刺激或抑制了土壤中微生物的活性,引起土壤微生物群落结构的改变。A. C. Das(2000)研究不同杀虫剂对土壤微生物影响,发现HCH部分的有机磷杀虫剂等在田间合理的剂量下使土壤中细菌迅速增加

20、,对放线菌、真菌刺激作用则不显著。通过对微生物具体种属的研究发现,对土壤中的优势种群影响不大,而次优种可能受到抑制导致其他种群大量生长,从而引起土壤微生物多样性其及结构的变化 35 。同时,有一些杀虫剂不能被一种微生物降解,但可以微生物之间进行的共代谢分解 36 。另外,还有一些杀虫剂对土壤中微生物产生毒害的影响 37 。Novka等曾报道除草剂与微生物量的负相关性,尤其在水热条件差的情况下,增加剂量和高频率使用,以及几种除草剂的混合使用,微生物生物量和呼吸强度降低,群落结构发生变化 38 。可见农药,除草剂等化学外源物质加入土壤对土壤微生物的影响比较复杂,受农药,除草剂类型、剂量、施用方式,

21、以及土壤类型、温度和水分等条件的影响。施肥对土壤微生物影响也很大,张翔等(1998)通过15年定位研究发现施肥能明显增加微生物数量,长期施用化肥或配合施用有机肥和无机肥比不施肥,单施肥耕作层微生物数量增多 39 。W. Borken (2000)研究了长期堆肥处理对森林土壤微生物呼吸、土壤微生物生物量碳、氮,土壤有机碳,土壤总氮的影响,结果发现施用堆肥初期土壤中微生物活性,数量增加,但是2年后土壤有机层微生物活性,呼吸下降,而土壤矿物层微生物活性、呼吸却升高,原因可能是由于熟化堆肥长期处理改变了堆肥养分的释放和土壤有机层的可溶性有机质量的改变,另外熟化堆肥使用量的不同对土壤微生物影响效应也有差

22、异 40 。施用肥料除了直接影响土壤化学成分变化,引起土壤微生物活性,土壤微生物群落结构改变外,肥料能改变土壤的物理性状,影响地上植被的生长,从而间接的影响土壤微生物群落结构。Katarina and Erland ( 2004)研究了不同氮肥对根际微生物的影响,氮肥的增加引起根系分泌物的改变,铵态氮肥使根际微生物吸入胸腺嘧啶的量减少,根际pH值下降,植物茎长度比对照短,而硝态氮肥没有明显影响 41 。将石灰、木灰等施入土壤中进行土壤恢复在农林生态系统管理上是一种常用的措施,并随近年来化肥施用引起环境污染, 使得这一措施更为重要。Zimmermann and Frey (2002)研究发现在酸

23、性森林土壤中施入木灰(wood ash)以后土壤微生物活性短期急剧增加,而对土壤化学性状影响比较持久 42 。另外,B¼¼ th and Arnebrant (1994)研究发现WA应用对土壤微生物活性增加有长期效应 43 。WA 应用于森林生态系统对森林土壤微生物影响,一方面增加了土壤中微生物可利用的营养元素,另一方面改变了土壤物理形状,从而引起土壤中微生物群落结构的改变。1.3.2连栽、轮栽等措施在农业和林业经营上有连载、轮作和间作等不同的模式,并且由于栽种不同的植物,导致土壤中微生物差别很大。这是因为不同的植被其凋落物,根系分泌物等进入土壤可以被土壤微生物利用的食物资

24、源不同,而且地上植被能影响到土壤温度、湿度等环境因素,从而对微生物结构产生不同的影响。陈灏等通过对种植不同农作物的农田进行16SrNA分析发现种植不同作物的农田中存在其特殊的微生物种群 44 。在森林生态系统中不同林型条件下土壤微生物群落结构差别更大,因为在森林系统中土壤微生物主要的营养来源是植被凋落物。在人工林系统研究中发现混交林土壤中微生物多样性比纯林多样性高,纯林土壤生物多样性下降可能是近年来人工纯林土壤衰退,森林生产力下降原因之一 45, 46 。在农业和林业生产上存在一个普遍的现象是连作障碍。所谓连作障碍就是指在同一块地上连续栽种同一种作物或树木后,其生产力下降。对于这种现象科学家对

25、其进行了广泛的研究,很多研究发现连栽后土壤中微生物多样性降低了,土壤中出现了一些产生有害物质的微生物,从而导致连栽杉木人工林土壤质量下降 19 ;杜国坚等(1995)研究发现连栽杉木林地土壤微生物中的细菌、放线菌数量下降而真菌数量出现增加 47, 48 ;也有研究发现杉木连栽后土壤中根际微生物数量增加,非根际微生物下降的现象,这可能是连栽导致根系分泌改变的缘故 49 。而进行轮作或栽种混交林后能使土壤微生物群落结构改善,陆地生态系统中物质、能量循环得以顺利进行,使林地生产力得以提高 45, 46 。1.3.3因物种的引入等措施近年来,随着分子生物技术的发展与应用,越来越多的转基因植物被用于农林

26、生产中. 转基因植物引入生态系统后,会对环境产生怎样的影响成为科学家关注的问题,转基因植物对土壤中微生物群落结构产生怎样影响也引起有关学者的重视。Donegan等(1995)研究了一种能产生内毒素的转基因棉花对土壤中细菌、真菌数量和结构的影响。他们发现产生内毒素的转基因棉花使土壤中微生物数量出现短暂的增多,用BIOLOG系统和DNA指纹技术等方法发现土壤微生物结构也发生变化。但是如果只加入纯净的毒素对微生物区系多样性影响则不显著。他们认为,不是由于外源底物引起微生物群落结构发生变化,可能是由于外源基因的引入使植物体内在的化学特性发生了改变,从而使植物分解加快,促使土壤微生物数量增加,土壤微生物

27、群落结构变化 50 。但是,究竟怎样影响土壤中微生物的群落结构,影响程度多大还有待今后进一步的研究。另外,也有大量转基因的微生物被释放到环境中用来降解环境中的污染物质,这些转基因微生物释放到环境中的会对土壤中原有的土著微生物群落结构产生怎样影响,都应该成为我们今后研究的问题。2土壤微生物群落结构研究方法2.1生物标志物（Biomarker）法使用生物标志物来定量描述土壤微生物的群落结构组成是最常用的方法之一。这种生物标志物通常是微生物细胞的生化组成成分或是细胞外分泌产物。当测定土壤中这些化合物时，首先使用一种合适的提取剂直接把其从土壤中提取出来，然后对提取物进行纯化后用合适的仪器加以定量测定。

28、用这种方法来定量描述土壤微生物的群落结构组成的优点是既不需要把微生物的细胞从环境样中分离，同时又能克服由于对微生物培养而导致不同微生物种群可能会发生选择性生长所造成的麻烦。磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）图谱分析、脂肪酸（fatty acid, MFA）谱图以及甲基脂肪酸酯（fatty acid methyl ester, FAME）谱图分析在群落动态分析上的应用十分广泛。磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%3。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。另一个重要因素是脂

29、肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来4，然后用气相色谱分析，得出PLFA 谱图。群落的微生物结构发生变化，即可以通过谱图的变化得到快速有效的监测。甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，该法利用MIDI 系统（一种气相色谱分析系统）分析出全细胞的FAME 谱图。Wilkinson SC5等人用PLFA 谱图法找出了微生物群落与树木根系的关系。Haack6等人通过试验验证了FAME谱图法分析土壤微生物群落的可行性，还同时进行了生物量、分类结构实验，结果表明FAME 谱图法能够监测土壤微生物群落细微变化。为人们提供了一个监测土壤

30、微生物群落结构的常规方法。Yao Huiying7等应用PLFAs 分析了8 个不同肥力水平和种植历史的中国红壤的微生物群落结构，发现PLFAs 总量与土壤有机C、总N、微生物量C和基础呼吸呈显著正相关，种植历史和植被类型对土壤微生物群落结构有很大影响。FAME 分析法为种内关系的建立提供了一个快速而可靠的方法，但不同属甚至不同科的微生物的FAME 有可能重叠，因在区分关系较远的微生物应用上有一些困难。但以 FAME 的多样性来表示一个不太复杂的生态系统的生物多样性仍有一定的参考价值。2.2 BIOLOG 微平板研究单一碳源底物利用能（Sole-Carbon-SourceUtilization

31、，SCSU）该方法最初由美国的 BIOLOG 公司于1989 年开发成功，最初应用于纯种微生物鉴定，至今已经能够鉴定包括细菌、酵母菌和霉菌在内的2000 多种病原微生物和环境微生物。1991 年Garland 和Mills开始将这种方法应用于土壤微生物群落的研究8,9。这种方法是基于微生物群落对 95 种不同C 源的利用度来描述群落中微生物的动态变化。微平板中有氧化还原指示剂和95 种不同C 源，加入样品后，由于样品对每种C 源的利用能力不同，导致氧化剂颜色变化不同，用分析系统分析结果，就可以得到群落代谢的变化情况。这样，这种C 源利用度的信息就可以用来研究不同环境条件引起的微生物群落变化。杨

32、元根等10用Biolog方法研究了英国阿伯丁市城市土壤和邻近农村土壤的微生物群落结构和功能多样性。结果表明，在重金属元素的胁迫下，城市土壤的微生物群落与农村土壤相比发生了显著的变化。由于不同的微生物对同一 C 源的利用能力是有差异的，微生物对不同单一C 源的代谢指纹差异并不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异，而且土壤微生物在BIOLOG 系统中生长时，由于温育环境的改变引起微生物对C 底物实际利用能力的改变，使得BIOLOG 方法在准确性方面受到一定限制，但BIOLOG 方法因快速、简便而受到人们的欢迎。2.3 土壤总DNA 复性分析通过测定土壤 DNA 的碱基组成和复杂性可估计出总的遗

33、传结构及其复杂性。分析DNA 的溶解曲线可以得到碱基组成的G+C 百分比。对于一个恒定的DNA 浓度来讲，复性速率是DNA 多样性的倒数。Britten 和Dohne11引入C0t1/2 这个术语来表示基因组的大小，C0 表示实验开始时，单链DNA 中碱基对的原始摩尔浓度，t1/2 表示半数DNA 发生复性时所需要的时间， 它是以秒为单位的（C0t1/2=K-1）。他们证实从一个种中分离所得的DNA，在没有DNA 重复序列存在时，它的C0t1/2值和这个种的基因组大小成正比。从土壤中抽提所得到的DNA 是各种不同类型微生物DNA 的混合物，其比例也有着很大的差异。C0t1/2 值提供了DNA复

34、杂性的资料。目前，已将C0t1/2 作为多样性的指标，它是测定群落总的遗传复杂性的方法之一，它反应了群落中信息的量以及这些量是如何分布的。Torsvik 等12用DNA 复性试验研究了挪威一处山毛榉树林土壤的微生物群落多样性。根据试验结果估计每克土壤中大约有4000 种微生物。土壤总 DNA 复性分析是较早应用的方法，该方法对土壤微生物组成结构的估计是比较粗放的，准确性也差，提供的信息少，现在已很少使用。2.4 以PCR 为基础的rRNA 及rDNA 的分析方法rDNA 在细胞中相对稳定，拷贝数多，并存在于所有细菌中。rDNA 由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细

35、菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。原核生物的rRNA 分为3 种，分别为5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，并且它们位于同一操纵子上。其中，16S rRNA 序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，23S rRNA 分子比较大，并且只有少数种的核酸序列被报道，尚未在细菌分类和鉴定中得到广泛应用。16S 23S rDNA 间区（Intergenic SpacerRegion, ISR）由于没有特定功能和进化速率比16SrDNA 大十多倍，近几年来在细菌系统发育学，特别是在相近种和菌株的区分和鉴定方面占据一席之地。由于以上序列每年都以很快的速度补充到Genebank

36、中去，这使得微生物工作者能够比较方便地利用这一数据库进行微生物群体多样性研究。性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）自从Myuzer13首先将DGGE 技术应用到分子微生物生态学后，已证明这类电泳技术是揭示土壤中微生物群体遗传多样性的有效手段，可用于污染土壤中微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析等。DGGE和TGGE开始时在医学上用于检测基因突变，后来被广泛应用于微生物生态的研究。同样大小的DNA 序列由于含有的碱基不同，各片段的Tm 值也就不同。甚至一个碱基对的不同，都会引起Tm 很大的差异，DGGE 或TGGE 就是应用这种差异来区分不同的基因序列。这种电泳方法在聚

37、丙烯酰胺中加入甲酰胺（DGGE），从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度（TGGE）。电泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。而且染色后的凝胶用成像系统分析，还可以半定量地测定样品DNA 浓度的大小。反映微生物群落组成的变化。该方法扩增土壤样品的16S rRNA 的部分基因序列（100 400bp），通过DGGE 或TGGE 分离收集不同条带的DNA 测序，再同GENEBANK 中现有的序列比较即可确定微生物种类。该方法分析土壤微生物群落结构组成具有快速、重复性好等优点，目前在土壤微生物群落结构分析上应用最为广泛。但该方法在对土壤微生

38、物群落结构进行精细解析上具有一定的限制性，因为对于G+C 含量相同但碱基序列不同的片段难以区分。Said EL Fantroussl 等14提取了长期使用3 种Phenylurea 类除草剂（diuron, linuron, and chloro toluron）的土壤中总DNA，采用16Sr RNA 通用引物PCR 扩增了16S rDNA，通过分析DGGE 的条带模式，发现除草剂污染的土壤和没有使用过除草剂的土壤微生物群落结构有显著的不同，并且使用过除草剂的土壤微生物多样性减少了。而且还通过测序几种变化的DGGE 条带，发现diuron 和linuron 污染后影响最大的属于几种未被培养的微

39、生物类群。 6S rDNA 的限制性片段长度多态性（RFLP）分析（ARDRA）提取土壤中的微生物总DNA，以通用引物扩增16S rRNA 基因，并构建于载体上，转化大肠杆菌，建立16S rRNA 基因文库，随即选取一定数量的克隆，以特定的限制性内切核酸酶消化16S rRNA 基因，通过电泳分析消化后的片段长度多态性，来反映微生物群落结构的多样性。Dunbar 等15同时利用分离培养物和直接从土壤中提取的16S rDNA 基因的RFLP 图谱分析了松树根圈土壤（pinyon rhizosphere soil）和树间的土壤（between-tree soil）微生物的群落结构，他们通过Rsa_和

40、BstU_两种限制性内切酶分别分析了179 种分离培养物和801 种直接从土壤中提取的16SrDNA 基因的RFLP 图谱，发现从土壤中直接提取的有498 种系统型（Phylotype）而在分离培养物中却只有34 种。并且还发现松树根圈土壤中的微生物丰富度大于树间的土壤。ARDRA 方法是基于碱基的排列顺序为依据的，更具有精确性，而且，土壤16S rRNA 基因文库越大，反映土壤微生物的结构越全面，该方法获得的序列还能准确的反映菌株的系统发育信息。ARDRA 方法最大的缺点是工作量大，目前，应用该方法进行微生物群落结构分析，还没有人设置重复。 16S rDNA 末端标记限制性片段长度多态性分析

41、（T-RFLPs）由于16S rDNA 的限制性片段长度多态性（RFLP）分析（ARDRA）所产生的片段多，分析起来工作量大，人们在此基础上又发展了一种高效、灵敏的方法。该方法在用细菌通用引物PCR 扩增16S rRNA 基因时，在其中一条引物的5_末端用荧光素进行标记，然后对土壤样品DNA 进行PCR 扩增。扩增产物16S rDNA 经特定限制性内切酶消化后，经电泳分离，荧光素标记的末端片段经显色后，可以比较精确的确定标记末端的片段长度，或对其进行测序，末端标记限制性片段长度多态性分析是研究土壤微生物多样性和结构的一种有效而快速的手段。它克服了ARDRA 方法工作量大、分析烦琐的缺点，同时又保留了ARDRA 方法分析精度高、能获得土壤微生