生物防治-06转基因抗虫植物

1、转基因抗虫植物按美国的情况，该章应为植物农药国务院于2001年5月颁布了转基因生物安全管理条例农业转基因生物：在2001年5月国务院颁布的转基因生物安全管理条例 中，农业转基因生物是指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或 者农产品加工的动植物、微生物及其产品，主要包括：（一）转基因动植物（含种子、种畜禽、水产苗种）和微生物；（二）转基因动植物、微生物产品；（三）转基因农产品的直接加工品；（四）含有转基因动植物、微生物或者其产品成份的种子、种畜禽、水产苗 种、农药、兽药、肥料和添加剂等产品。转基因抗虫植物：是基于外源杀虫基因的导入，培育成的抗虫性的植物。虫害是制约农作物高产的重要因素，

2、世界每年因虫害造成的损失约占农作物总产量的15%以上。化学 农药的施用在减少虫害的同时引起一系列副作用，如提高成本、污染坏境、诱导害虫产生抗药性、引起次 要害虫的大发生等。通过基因工程手段培育抗虫新品种（系）可从根本上解决3r问题，对哺乳动物和一些有益昆虫不产生 毒害作用，且不造成坏境污染，具有广阔的应用前景。目前全世界最常改良的性状中抗虫占第二位（24%）, 到1998年已商业化的6类性状中抗虫占15%0人们已从细菌中、植物本身以及昆虫体内发现并分离到许 多抗虫基因，有许多抗虫转基因植物正在进行皿间试验，并有一些品种已商品化。迄今发现并应用于提高 植物抗虫性的基因主要有两类:一类是从细菌中分

3、离出來的抗虫基因，如苏云金杆菌毒蛋白基因（bt基因）、 异戊基转移酶基因（ipt）,另一类是从植物中分离出來的抗虫基因，如蛋白酶抑制剂基因（pi基因）、淀粉酶 抑制剂基因、外源凝集素基因等。其中基因和pi基因在农业上利用最广。一、bt杀虫晶体蛋白（bt毒蛋白）基因bt杀虫晶体蛋白tcp,是单基因直接表达的产物，不同基因型所表达的产物具有显著不同的杀虫特异 性。自1981年schnepf等克隆了苏云金芽抱杆菌的第一个tcp基因，并于1985年发表了它的dna碱基序 列及其编码蛋白的氨基酸序列起,迄今己发现和克隆了 170多种icp基因。因此，弄清tcp基因型，对于 菌株鉴定及筛选、杀虫特性的了解

4、、杀虫谱的改良等，都具有重要意义。90年代以来，聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, pcr）技术以其快速、简便、灵敏的特点在bt tcp基因的鉴定上得到了广泛 应用。本文就bt tcp基因pcr鉴定的策略进行探讨，并对其进展作一冋顾。l.bt毒蛋白的杀虫机理bt是苏云金杆菌baciius thuringiensis的简称，是一种革兰氏阳性土壤芽胞杆菌。通过克隆技术确 定bt基因位于30150md大小不同的质粒上，其中毒性区间位于该序列n端29607个编码区，c端有高度 的保守性，对稳定晶体蛋白结构可能起着重要作用。bt杀虫活性源于芽胞形成时产生的杀虫结晶蛋白

5、 （insecticidal crystal protein, tcp）或苏云金杆菌毒蛋白（bt toxic protein）,其中应用于农业生产 的主要是5内毒素。己知5内毒素为13ct160kd的多肽，在伴范晶体内是以原毒素（protoxin）的形式存在, 经体外碱解或在昆虫肠道内被蛋白酶水解成5570kd或更小的多肽，与敏感昆虫中肠道上皮纹缘细胞(brushborcler membrance) ±的待异受体位点结合，引起并破坏纹缘膜细胞渗透压平衡，使细胞裂解，杀 死昆虫。2. bt霉蛋白基因分类自1901年发现苏云金杆菌以來，现已分离出4万多个bt菌种，报道了 51个血清型，5

6、0多个亚种， 已克隆出60多个毒素基因。不同基因型杀虫谱不同，毒蛋白的大小及形状也不一样。根据杀虫谱的不同, 将杀虫基因分成六大类，统称为cry基因，用罗马数字i、it. ite tv等來命名，分别代表几种杀虫范 围。在每一类型下根据氨基酸序列的同源性，又分为a，b, c等不同的基因型。在同一基因型下根据限制 性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为a, b, c等不同的基因亚型。其分类如下：cry t基因型编码对鳞翅h昆虫有毒杀作用的菱形伴抱晶体蛋白，约30140kd,在昆虫中肠内降解为 6070kd的多肽,在cry i基因间,氨基酸同源性为82%90%的归为cry i a;55%71%的归为c

7、ry i a基因 中，根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小,又分为:cry t a (a), 4. 50kb; cry t a (b), 5. 30kb; cry t a (c), 6. 60kb 亚类基因。cry tt基因通常编码对鳞翅li和双翅li昆虫有毒杀作用的立方体伴孑包晶体蛋白，约65kd。而cry tt b 只对鳞翅目昆虫有毒性，它们之间的同源性达80%左右。cry tit基因编码对鞘翅目昆虫有特异毒杀作用的长方形伴孑包品体，约72kd。cry tit a基因与cry t 和crytv基因的毒性核心5'端编码区有同源性，与3'端编码区有所不同，如果将3'端去

8、掉，将失去杀虫 活性。cry tv基因编码对双翅目昆虫有特异毒性的椭园形伴抱晶体。cry tv a, 135kd;cry tv b, 128kd;cry tvc, 78kd;cry tv d, 72kd, cry tv a和cry tv b基因在结构上与cry t相似，毒性核心区段为5378kd, 位于原毒素蛋白的n端。3. bt杀虫晶体蛋白基因的修饰、改造及应用虽然早期的转抗虫基因植物或多或少都对昆虫有些抗性，但杀虫蛋白在植株上的表达量很低(占全部 对溶性蛋白的0.001%以下)，抗虫效果不理想。其主耍原因是目前使用的杀虫晶体蛋白大多来源于细菌， 与高等植物结构基因正常的dna序列相比，b(

9、基因含有较多的at碱基和attta重复序列。at富含区 在高等植物中被认为是不能表达的内含子，attta重复序列的mrna的稳定性差，二者都不能在高等植 物中编码。此外，bt基因中的偏爱密码子与植物中的不同，以及其中存在的一些不稳定元件如poly(a)信 号序列、切割序列、终止序列等都直接影响着bt基因在植物中的mrna特性。为此，monsanto公司从两 条途径对原基因进行了改造。第一条途径是改进ti质粒转化载体的启动子，加入带有sv40复制增强子区的35s启动子或重复的强 化表达区(duplicated enheinced region),发现改建后的载体表达量比原先提高了 510倍(pe

10、rlak等，1990)。第二条途径是根据植物偏爱的密码子对野生型(wt)bt基因cry i a(b)进行部分改造或人工全合成， perlak等对wt cryia(b)at富含区进行点突变，改变其中63个碱基对，at含量由63%下降至59%,而 attta重复序列也从13个减少至7个，部分改造后的基因称为pmcryla(b)。pmciyla基因在转化的烟 草和番茄屮的表达量为l-10ng/50ug植物可溶总蛋白，比wtcryla(b)在转基因植物屮的表达u：(<lng/50ug) 提高了 10倍。进一步在不改变编码的氨基酸序列的前提下，几乎更换掉wt基因中的所有不稳定元件， 同吋尽可能将其

11、中的密码子换成植物优化密码子，at含量下降至51%,去掉所有attta序列。全合成的基因称为fncry i a（b）用其转化烟草 番茄，10%以上的转化植株表达量达30-100n/50ug植物可溶总蛋白， 最高的可达100-150ng/50ug,比wtcryla（b）的表达量提高50-100倍，表现较强的杀虫效果。近年來人们在bt杀虫晶体蛋白基因的修饰与改造、表达载体的构建、植物组织化、抗虫植物的培育 等方面作了大量工作（knutigcr,1997）。我国也从1991年起开始了 btcryla杀虫基因的部分改造或全合 成，并导入棉花、烟草、甘蓝等25种以上植物获得成功。目前全世界已获得50多种

12、不同的抗虫转基因植 物，技术趋向成熟，成果向簡品化、实用化阶段深入，并开展大规模的出间推广试验。从1995年起，cryl a类转基因玉米、棉花和马铃薯已商品化，性状有单基因的抗玉米螟、抗棉铃虫和抗马铃薯甲虫，还有玉 米和棉花的多基因抗虫+抗除草剂必状（表1）。表1转bt基因植物工程植物目的基因转化方法参考文献engineering plantstarget genetransformation methodreference烟草cryla（a）（抗烟草天蛾）农杆菌介导barton 等1987tobaccocry i a（b）（抗烟草天蛾）农杆菌介导vacek 等1987cry i a（c）（抗

13、烟草青虫）农杆菌介导出颖川等1991bf（获纯合体株系d8-14, d 19-8）农杆菌介导李太元等1994cryla（b）（切去3,端，留640序列）农杆菌介导fischhott 等1987番茄cry i a（b）（抗口科鳞翅目）农杆菌介导delannay 等1989tomatobt （抗番茄果虫，番茄蠹蛾）农杆菌介导smith 等1990cry i a（b）（减少 a + t 含量）农杆菌介导pcrlak 等1991bt+cmv-cp农杆菌介导梁小友等1994马铃薯cry iii a农杆菌介导cheng 等1992potatocrylh a农杆菌介导oerlak1993cry i a（c）

14、农杆菌介导ebora1994棉花bt（转原生质体）农杆菌介导el-hiatcny 等 1990cottonbt （下胚轴 npt ii kan'）农杆菌介导unibeck 等1991bt农杆菌介导benedict 等1992粳稻cry i a （抗稻纵叶卷螟）电击法（原生质体）fujimoto 等1993japonica rice水稻btp eg 法(pei 121)杨虹等1989ricecryla（b）（未见抗虫性报道）花粉管通道法谢道昕等1991cry i a(b)基因枪法（胚性愈伤）许新萍等1997cry i a(b) cry i a(c)农杆菌介导成雄鹰1998釉稻cry i

15、a(b)基因枪法wunnj 等1996indica rice釉稻和粳稻cry i a(b)(三化螟)基因枪法datta 等1998indica andjaponica rice玉米cry i a(b)基因枪法koziel 等1993maizebl、bar子房注射丁群星等1993bt超声波张宏等1993bt基因枪法王国英等1993大豆bt （未见杀虫效果报道）农杆菌介导（lba4404）parrott 等1994soybeanbt侵染子叶节徐香玲等1997苹果bt农杆菌介导程家胜等1994apple甘蔗cryla（c）（抗非洲蔗螟）农杆菌介导fitch 等1996sugarcane二、蛋白酶抑制

16、剂基因（pi基因）pi是自然界最为丰富的蛋白质之一，存在于绝大多数生物体尤其是许多植物的贮藏器官，如种子和块 茎中，是一类天然的抗虫物质，与前述苏云金杆菌相比，具有抗虫谱广、对人畜无副作用及昆虫不易产生 耐受性等优点（gatehouse, 1988）。在植物界，现已发现近1（）个蛋白酶抑制剂家族，与抗虫基因工程关系 最密切、研究最深入的是丝氨酸蛋白酶抑制剂，基中最主要的是胰蛋白酶抑制剂。因为绝大多数昆虫所利 用的正是这一类消化酶，而植物细胞基本没有这种酶，或含量甚微。pi同昆虫消化道内的蛋白消化酶形成 复合物，阻断或削弱蛋白酶的水解形成复合物，阻断或削弱蛋白酶的水解作用，使昆虫厌食或消化不良致

17、 死，从而达到抗虫目的。目前已从ke豆、马铃薯、番茄、大豆、玉米等植物中分离纯化出多种蛋白酶抑制剂基因或cdna克隆。 主要有珥豆胰蛋白酶抑制剂基因（cpti基因）、马铃蒋胰蛋白酶抑制剂基因（pti基因）、玉米半胱氨酸 蛋白酶抑制剂基因（cpi基因）以及大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因（skti基因）等。比较不同来源 的各种蛋白酶抑制剂，发现cpti抗虫效果较为理想，其抗虫范围广，对鳞翅目、鞘翅目、直翅目等几乎 所有昆虫都有杀伤作用，而且其作用位点在酶的活性中心，突变的可能性小，昆虫产生抗性突变的可能性 儿乎没有，目前已应用于抗虫烟草、水稻、大豆，但由于其表达能力不够强，应用暂时受到限制。

18、1997年 高越峰、朱祯等人从未成熟的大豆子叶中分离出skti基因，为多基因家族，可抑制不同来源的胰蛋白酶 活性，尤其对鳞翅目昆虫有较强抑制作用，且skti对胰蛋白酶活性的抑制能力明显高于cpti,显示出较 好的应用前景。表2列出蛋白酶抑制剂基因主要应用实例。表2转蛋白酶抑制剂基因植物工程植物日的基因转化方法参考文献engineering plantstarget genetransformation methodreference烟草cpti农杆菌介导hilder 等1987tobaccopti农杆菌介导thornburg 等1987水稻cpti农杆菌介导刘春明等1992riceskti （

19、抗棉铃虫）农杆菌介导咼越峰等1998cpti （抗二化螟、三化直接转化莽克强等1993螟）基因枪法vain 等1994cpi （抗线虫）基因枪法kentaro 等1996cpi （抗玉米象）三、抗虫基因工程潜在的问题、解决途径及展望伴随抗虫基因工程进展，其在应用方面潜在的问题也日益显露。首先是昆虫对bt毒蛋白产生抗性的问题。原因之一：根据bt毒蛋白的杀虫机理，在长期选择压力下, 昆虫纹缘膜细胞上的受体位点会发生改变，使品体蛋白不能与纹缘膜细胞上的受体位点结合，失去毒杀作 用，结果昆虫就产生抗生。为此，可以采取以下策略，（1）将不同杀虫机理的杀虫蛋白基因;如具有广谱抗 虫特点的cpti基因以及其

20、他多肽毒素基因结合bt基因转化植物来抑制昆虫产生抗性。（2）采用诱导型或组 织特异性表达的启动子与bt毒蛋白基因构成嵌合基因，获得特异性表达的抗虫品种。使bt基因只在害虫 侵害时或者只在植物易受害虫侵害的部位或者只在一定的条件下（如化学调节剂）高效表达，以减少耐受性 昆虫的发展。（3）把高剂量表达的转基因植物与非转基因植物混合播种，使在bt植株上具有纯合抗性基因 的抗性昆虫与非转基因植物内易感昆虫交配，它们的后代成为杂合体，这样可以去除昆虫产生的抗性基因, 防止抗性等位基因在昆虫群体屮固定。原因z二：bt毒蛋白的抗虫谱较窄，某一特定的毒蛋白只对某一种 或儿种害虫具有毒杀作用，害虫易对其产生抗性

21、。对此可同时使用两个以上的bt毒蛋白基因转化植物。 不同的bt毒蛋白，根据与竺定昆虫中肠纹缘膜细胞不同受体位点的结合程度，分为竞争性结合 （competitively binding）和非竞争性结合（noncompetitively binding）蛋白,如果两种晶体蛋白竞争结合昆虫中 肠全部受体位点，就称为竞争性结合毒蛋白;如果与第一种毒蛋白结合的受体中有一个或多个不为第二种蛋白所竞争，反之亦然，那么，对该昆虫来说，这两上毒蛋白都是非竞争的。将编码非竞争性结合毒蛋白的 2个或2个以上基因同时导入植物，能在很大程度上延缓害虫所产生的抗性。第二个问题是目前bt毒蛋白基因在转基因植物体中的表达水平

22、普遍较低，存在基因“沉默”和甲基化现 象，不能有效地毒杀害虫。基因沉默与目的基因在受体植物屮的甲基化状况、拷贝数、插入受体染色体位 点及是否与受体植物中有同源基因等因素有关。目前主要釆取以下措施来克服基因沉默现象；（1）避免多拷 贝外源基因整合到受体基因组中，如利用ac/ds转化载体、双元细菌人造染色体载体、构建核基质支架附 着区载体系统。（2）用具有特殊功能的启动子与增强子调控。（3）在有性世代后代中筛选单拷贝转基因个体。（4）继续深入研究dna的空间结构以及各种调控因子和坏境因子对转基因的影响。jaquet等分析至少有 三种因素影响杀虫活性:毒素的来源、晶体的溶解性和昆虫对毒素的内在敏感性

23、，昆虫对毒素的 内在敏感 性至少还与中肠液ph、蛋白酶活性和毒素受体的类型、数量有关。bl毒蛋白有134个亚类，它们一级结 构的差异以及昆虫中肠上皮细胞上的受体是影响杀虫晶体蛋白毒力和杀虫特异性的两个重要因素。随着转 基因沉默机理研究的不断深入，这种现象最终必将会得到克服。抗虫植物基因工程是一项应用性极强的研究，它使短时间内培育出抗虫品种成为可能。同时止在进行 田间试验的性状屮，多基因抗虫性状也屡次岀现，将bt基因、特殊的抗病基因、抗除草剂基因及优良品 质基因集聚于同一品种。相信不久的将来，会有越来越多的多基因抗虫品种问世。杀虫晶体蛋白的来源：insecticidal crystal prot

24、ein,简称icpsbt是苏云金芽抱杆菌的简称，是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌， 于1901年，由ishwata在受害的家蚕中发现的，命名为猝倒杆菌，但当时没有 保存下来。1909年，berliner从徳国苏云金的地中海粉螟中重新分离到bt,并 止式定名为苏云金杆菌，从20世纪20年代起，bt开始大规模生产，并被用来 防治欧洲玉米螟，但直到1950年，人们才了解到bt的杀虫活性是定位在芽鞄 形成时产生的晶体蛋白所决定。由于这些蛋白具有杀虫活性，故被称为杀虫晶 体蛋白，或§内毒素。编码基因称为cry基因。1981年,sunepf等人首次成功地克隆了笫一个编码bt杀虫晶体蛋白的基因

25、, 解开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕，迄今为止，c先后分离岀4万多个 bt菌株，68个亚种，对45个杀虫晶体蛋白基因序列进行了分离测定，bt基因 c被成功地导入玉米、棉花、马铃薯等各种植物，获得了一大批具良好抗虫性 的转基因植物品种和种质资源，产生了显著的社会经济效益，冃前btc成为植 物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因。编 码杀虫晶体蛋白icp的基因称为cry基因。蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitor, pi）存在于自然界所有生命中的 多种蛋白中。在植物的大多数储藏器官如种了和块茎中，各种蛋白酶抑制剂的 含量可占总蛋白的1-10%,有些可达

26、30%。迄今已在植物中发现有3类蛋白酶抑 制剂：丝氨酸酶抑制剂、蔬基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。对丝氨酸类蛋白酶抑制剂的了解最深入，此类蛋白酶主要是针对消化道内 ph值为中性或碱性的害虫种类，如大部分鳞翅冃、直翅冃、双翅冃、膜翅冃及 某些鞘翅目昆虫，以上昆虫所利用的蛋白酶为丝氨酸蛋白消化酶。疏基蛋白酶抑制剂主要针对消化道内ph为酸性的昆虫，如大部分鞘翅目昆 虫。金属蛋白酶抑制剂研究较少，而且对昆虫的生长作用不大。目前在已克隆的多种蛋白酶抑制剂基因及cdna （以nirna反转录成）中，表 现较好并显示具有良好的抗虫性能的有3种，即直豆胰蛋白酶抑制剂基因，马 铃薯蛋白酶抑制剂ii基因及水稻毓

27、基蛋白酶抑制剂基因。直豆胰蛋白酶抑制剂基因：在棉花转基因抗虫植株中，最重要和最具有应 用前景的是2：豆胰蛋白酶抑制及基因cptio cpti基因是从班豆品种tv2027中 分离克隆出来的，它表达所产生的直豆胰蛋白酶抑制因子能抑制昆虫所必须的 消化酶的生物活性，使昆虫的生化代谢过程紊乱，引起昆虫不正常发育或由于 缺少必须的氨基酸而“饿死”。与bt相比，cpti具有光谱抗虫性，抗虫谱覆盖 许多农业害虫如鳞翅目、鞘翅目及直翅目的某些害虫。现国内已成功地将cpti 转入棉花中获得有明显的抗棉铃虫的棉花品种。马铃薯蛋白酶抑制剂-11基因：它是一类损伤诱导型表达的基因产物。国外研究 报道，当马铃薯或番茄在

28、受到害虫攻击或机械损伤时，叶组织中便可产生一系 列的蛋白酶产物，具重要成份是丝氨酸蛋白酶抑制剂。pi-ii的作用机制主要是 抑制消化酶为胰蛋白酶种类的昆虫。另外pi-ii基因的启动子对启动调控外源 抗虫基因很有作用，可使作物在受到害虫攻击时进行表达以完成防御目的，因 而更为经济和有效。水稻铳基蛋白酶抑制剂基因:毓基蛋白酶抑制剂的抗虫谱与cpti的抗虫谱互补, 它的基因可抑制谷盗米昆虫的消化酶，对昆虫的杀虫作用明显。3其它种类的抑制基因淀粉酶抑制剂：能普遍抑制昆虫体内的q淀粉酶的活性，其作用机理是 抑制昆虫消化道内q淀粉酶的活性，使食入的淀粉无法水解，阻断其主要能 源来源。同时抑制剂与淀粉消化酶

29、结合成酶一抑制剂复合物，也后刺激昆虫的 消化腺大量分泌消化酶，通过神经系统的反馈，使昆虫产生厌食反应，最后导 致非正常发育或死亡。外源凝集素基因：是自然界广泛存在与分布的一组蛋白质，是能特异的识 别并可逆地结合糖类复合物的糖基部分而不改变被识别糖基的共价价构的一类 非免疫性球蛋白。目前已从豌豆、雪花莲等植物中分离出数种凝集素，而且较 成功地导入植物中，并获得抗虫性能。外源凝集素主要储藏于植物细胞的蛋白粒子中，一旦被害虫取食，就会在昆虫的消化道中释放，并与肠道围食膜上的 糖蛋白相结合，影响营养物质的正常吸收。凝集素可以单独或与其它抗虫基因 同时转入植物中，有协同抗虫的作用，由于其抗虫能力强，对人

30、畜副作用小， 也是植物抗虫基因工程中较有前途的一种。二、外源抗虫基因的导入基于dna重组技术，抗虫基因+质粒载体一重组dna分子，然后转化植物 1农杆菌导入法较早的所有试验使用此方法，它是基于土壤脓杆菌的转化系统。农杆菌中 含有天然基因载体ti质粒，ti质粒是土壤微生物根癌农杆菌中的天然质粒。通 过伤口，这种菌可以侵染双子叶植物，最终导致植物伤口组织的增生形成冠瘻 瘤。试验中用的是经过改造的ti质粒。先将外源抗虫基因连接到ti质粒上， 转化农杆菌，再利用农杆菌进行植物细胞的转化。叶盘法是一种简单易行的植物细胞转化、选择与再生的方法。做法是先将 实验材料如烟草的叶子表面进行消毒，再有消毒过的不锈

31、钢打孔器从叶子上取 下小片，即叶盘。为了对叶盘进行接种处理，需将它放在农杆菌培养液中浸泡, 然后用滤纸吸干，将叶盘在培养基上培养经过一定时间后，叶盘周围会长出愈 伤组织并分化出幼苗。对这些幼苗进一步检测，可以确定它们是否含外源基因 以及外源基因是否表达。这种方法适用于能被农杆菌感染并能从离体叶盘上形 成愈伤组织再生成株的植物。是双子叶植物基因导入的主要手段。最早的研究是抗虫的烟草：比利时的植物遗传系统nv公司的科学家，通过ti质粒转移苏云金杆菌的6内毒素基因到烟草中，使烟草植株产生了对鳞翅目害虫的抗性，毒素基因在烟草内得到了表达，产生了毒素。在温室试验中, 所有与改良植株接触的幼虫在一周内全部

32、死亡，而在对照株上，死亡幼虫只占 5%,在另一组试验中，与改良株接触的幼虫在5天内死亡，它们对植株叶片的 危害很小；未改良的植株与幼虫接触后的4-7天受到严重危害，在10-15天后 被完全吃光。毒素是很有效的。研究表明，在植株内产生的毒素量与在苏云金 杆菌中产生的量近乎相等。此外，美国农业遗传学公司也使一内毒速度基因在 植物中得到表达。抗虫棉：将带有bt品体毒素基因的质粒，导入到棉花中，如基因表达，即 棉花植株中有杀虫毒素产生。就获得了抗虫棉。2.基因枪技术这是美国康奈尔大学生物学家sanford等（1983）研究成功的一种导入外 源基因的方法，此方法工作主耍是利用粒子加速器即基因枪将被加速的

33、金属微 粒（如鹄粒）包裹含有目的基因和标记基因的质粒dna,来轰击受体植物组织或 细胞，从而实现外源基因的遗传转化。finer等1990年采用此技术将编码b 葡萄糖背酯酶和氨基酸糖廿磷酸转移酶基因转入陆地棉栽培品种愈伤组织细胞 中，从而获得了转基因再生植株。3.花粉管通道法尽管此种方法在学术上尚有争议，但已由利用花粉管通道成功地将外源dna 导入棉花的报导。花粉管通道，即在棉花开花授粉后的一定时间内和珠心孔道 封闭之前，用微量注射器将外源基因溶液注射到子房内，外源基因通过珠孔和 珠心孔道，逐渐扩散到或在珠心孔道封闭的过程中被挤压到刚受精后的胚囊内。 在受精卵分裂的过程中，外源基因有可能被吸收整

34、合到受精卵细胞的基因组中, 从而完成外源基因导入和整合过程的转化。中国农科院生物技术中心与江苏经济作物研究所等合作，利用人工合成的 bt杀虫蛋白基因，通过子房注射外源基因转化植物受精胚囊的花粉管通道法， 成功地获得具高抗虫能力的抗虫棉。中国农网：转bt基因玉米：2001年11月12日吉林农业科学院利用花粉管 通道和组织培养方法，将bt基因转入东北玉米自交系，获得转基因后代。经人 工接种筛选出抗性植株，再对抗性植株进行分子鉴定。证实目的基因（bt）已整 合至受体玉米基因组内。并获得了抗虫达到2级水平和稳定转基因自交系。2001 年通过杂交检测，培育出高抗虫的玉米新组合。四、转bt基因植物存在的问

35、题及对策尽管运用基因工程技术得到了大量的转基因植物，bt植物在生产上已经展现 出良好的应用前景，但还有一些问题须加以妥善解决，否则，就有可能限制了 这些基因植物的商品化、实用化方向的发展，影响其持续利用，甚至产生一些 不良后果。这主要包括以下几个方面：昆虫对转bt杀虫品体蛋白产生抗性；转 bt基因植物性状的变异；转bt基因植物潜在的生态危险性。（一）害虫对转bt基因植物抗性的产生及防治 先介绍生产上及试验测定的抗性问题但目前存在的一些不容忽视的问题如bt杀虫品体蛋白的抗虫谱窄，对某一 特定的bt杀虫品体蛋白而言，它只对某一种或某几种害虫有毒杀作用，而且害 虫会对杀虫晶体蛋白产生抗性。针对以上问

36、题可采取以下措施：见另一文献（害 虫对转bt基因植物抗性的治理策略）多毒素策略：mcgaughey和johnson在致死率62%-81%下，用icps混合物处 理印度谷螟，结果抗性只比用单一 icp处理稍有延迟。欧阳立明等用bt标准品 cs3ab-1991库斯塔克亚种，主要含crylaa, cry 1 ab and cry 1 ac等毒素）和 cry 1 ac伴胞晶体制备物处理田间采集的中度抗性小菜蛾，4代后其对 cs3ab-1991 and cry 1 ac的半致死浓度分别较实验室敏感水平上升9倍和23.5 倍，表现出混合icps对小菜蛾的抗性有一定延缓。数据模拟显示，只有当每种毒素对敏感害

37、虫的致死率在95%以上且抗性基因为 隐形时，毒素混用才能较好延缓抗性。而bt制剂叶面施用耍达到95%以上的死 亡率代价太高，所以该策略对于常规喷施可能意义不大。但对能使敏感害虫致 死95%以上的高表达转基因植物具有应用价值。fitt等用数据模拟算出在一定初 始频率的抗性基因和害虫行为特性下，如果两种毒素混合物对敏感个体的致死 率在95%以上，即使单一毒素对抗性单杂合子的致死率为70%,抗性（指20% 以上害虫可在转基因植物上成活）也将延至100代以后。多毒素策略的实施有两种方式：一是将含不同毒素基因的种子预先混合后再种 植；另一是在同一作物中导入多种毒素基因，包括不同的icps毒素，也可以是

38、icps配合其它杀虫蛋白（如蛋白酶抑制剂、外源凝集素、蜘蛛杀虫胎等），值得 注意的是：它们之间应不产生交互抗性。以后发展新抗虫植物时，也应注意与 以前品种所含毒素不发生交互抗性。已培育出的能同时表达cry 1 ab and crylc基因的烟草和马铃薯，对甜菜夜蛾、 烟蜗夜蛾和烟草天蛾的抗虫效果好。这种表达多毒素基因融合产物的植物，不 仅抗虫谱更广，也有治理害虫抗性的效果。赵荣敏等将改造的icp基因与亘豆 胰蛋白酶抑制剂基因cpti融合后转入烟草，所获得的转双基因烟草对棉铃虫的 致死率达100%,比单含cpti植株的致死率（20%）和单含icp基因植株的致 死率（80%）都高。不过roush

39、1994认为，表达多毒素基因的植物也应与敏感 寄主植物搭配种植才更有益于延缓害虫的抗性。高表达与低表达策略：高表达策略要求表达的毒素能杀死所有抗性杂合子害虫, 由于杂合子交配会产生抗性纯合子后代，从而使抗性迅速提高，所以杀死杂合 子害虫是延缓抗性的重要途径。但高表达策略的风险表现在：a毒素表达量逐 渐减少。fitt等发现抗虫植物在生长初期杀虫效果很好，而后期较差。据推测， 可能随植物发育成熟，icps的表达量减少，或其它次生物质的合成增多，对icps 产生拮抗。icps的表达量也可能因植株受到高温或低温、干旱等环境胁迫而减 少。一旦表达量不足以杀死杂合子害虫，该策略就可能失效。b对大量初孵幼虫

40、 的高强渡选择压，将加速害虫抗性种群的发展。c由于抗虫植物区害虫数量大大 减少，天敌数量也将大为减少，从而使避难区天敌数量增多，减少了避难区的 敏感虫数，这违反ipm理论，也将加速抗性上升。考虑到高表达策略可能的风 险，该策略与避难区策略结合乃是最佳选择。低表达策略的目的是通过降低选 择压而延缓抗性上升。它只能轻微地控制害虫数量，所以只能应用于经济阈值 较低的作物，并且需要与ipm中的其它多种防治方法相结合。但农民并不欢迎 低表达的作物，研究者们大多认为低表达延缓抗性的效果不如高表达。避难区策略：避难区指在抗虫植物周围种植一些对目标害虫敏感的植物,一提供一些害虫的敏感个体与杂合子或极少量的纯合

41、子个体交配,达到稀释抗性基因, 降低种群抗性水平的目的。may曾提出一个预测害虫对杀虫剂产生抗性（指抗 性基因r占种群总基因的50%以上）所需的时间公式。依据该公式，产生抗性 所需的时间依赖与选择压和抗性基因与敏感基因之间基因漂移共同作用的结 果。在高选择压下，抗性产生较快。但如引入敏感基因以稀释r在种群总基因 中的比例，又将缓解高选择压带来的效应。而anthony通过对昆虫群体遗传和 生态的进一步研究，认为发挥避难策略最佳效果的条件是：使“偏爱作物”中 转基因植物敏感昆虫存活的百分数大于“非偏爱作物”中转基因植物敏感昆虫 的百分数。它还提出，当昆虫种群密度显著降低（下降80%以上）时，避寒区

42、 策略延缓抗性的效果显著下降。这些学者的推算都说明了终止避难作物、提供 敏感害虫对延缓抗性的重要意义。因此，该策略已被普遍应用。避难区的设置 （比例、分布方式等）受到诸多因素的影响，如害虫的食性、幼虫的运动性、 成虫的迁飞能力、取食抗虫植物后的害虫行为和发育变化等，其中，关键因 素是能否保证避难区害虫不受icps毒素的选择，以及敏感害虫与抗性害虫之间 能否随机交配。就前者而言，涉及到避难植物的分布方式：一是将抗虫植物与 普通植物的种子混合后播种，即随机分布；另一种是在抗虫植物区周围设区种 植。选择何种分布方式为宜要根据害虫的食性和运动性而定。对于幼虫单食性 和运动性差的害虫，如小麦瘻蚊、棉红铃

43、虫可选用随机分布方式；对于幼虫多 食性和运动性强的害虫，如玉米螟和棉铃虫，或成虫喜在株间运动取食 的害 虫，如科罗拉多马铃薯甲虫宜选用分区种植方式。如果害虫喜在株间运动取食, 但成虫并不飞往周围田区交配，则这两种分布方式的避难都将失去作用。随机 交配的实现受到害虫的迁飞能力和个体发育差別的影响。成虫迁飞能力弱的， 抗虫植物与避难植物之间的距离宜近；反之，宜远。另外，在抗虫植物上取食 而 成活下来的害虫与敏感害虫的发育速度不一致，只是抗性成虫与敏感成虫之间 不能随机交配，也将导致避难策略的失败。gould and anderson在室内条件下发 现，抗性个体发育速度缓慢。这可能使抗性害虫仍只能与

44、抗性害虫交配，从而 加速了抗性上升过程。不过，田间条件下发育慢的抗性个体生活力差，易死亡, 但有些害虫世代交替现象严重，其结果不能一概而论，尚需进行具体分析。美国规定：在bt棉栽种区附近要有2种隔离带：4%的未施农药区或20%非bt 区；玉米种植至少有20%的非bt玉米区；马铃薯的情况与玉米相同。特异性/诱导性表达：由于组成型表达要大量消耗植物自身营养和能量，并 对害虫形成稳定的选择压，如果改变icps结构基因的上游启动子，使毒素特异 性/诱导性地启动表达（如组织特异性、发育特异性、损伤诱导性或引诱剂诱导 性表达等。），通过特异性/诱导性表达，使选择压降低或不连续，以延缓害虫的 抗性上升。组织

45、特异性并非适用于任何作物或目标害虫，应考虑作物的经济特性和害虫的取食 行为。例如，对于害虫很少危害的马铃薯块茎部分就不必表达icps 基因，而棉花中的icps基因可以特异性表达于棉铃。如果害虫取食 部位多， 则该策略不仅不会延缓抗性，反而会加速抗性发展，因为害虫在生活史的敏感 阶段可以躲避特异组织内的icps毒素伤害，从其它部位取食，而在适应性强 的阶段取食 含icps的组织，使种群的成活虫数增加。组织特异性表达可以通 过组织特异启动子控制毒素蛋白的表达了实现。另外，通过叶绿体转化也可控 制毒素基因在昆虫易侵害的植物组织中特异性激活表达。发育特异性是指icps基因被限制在植物发育的特殊阶段（通

46、常是害虫发生 较重的时期）表达，而其它时间关闭基因的表达。例如，对于新西兰的特产几 维果，12月至1月的果实发育期是卷叶蛾的高发生时期，icps基因可以控制在 这个时期内高水平表达。果实收获后，可以关闭所有组织内的icps基因。这样 既可为哪些残留的害虫提供避难，又不带来经济损失，种植者会乐于接受。 诱导表达可以降低选择压，而且一旦被诱导则可保持高剂量，害虫防治效果也 很好。但必须以基因调控理论、经济阈值和对环境的生态影响为基础。其它策略：从ipm宗旨出发，对害虫治理应该同时施用多种措施，以防害 虫对其中一种产生高抗性。对于转icps基因抗虫植物，有许多措施值得考虑， 如增加天敌、利用性引诱剂

47、干扰抗性成虫交配、轮作含不同毒素基因的作物、 间作或套种其它寄主植物以及结合植物自身抗虫次生产物等，还应避免对避难 区敏感害虫和天敌施用杀虫剂等。展望：转基因抗虫植物在害虫综合防治中的地位日益重要，但如果不在一定的 抗性治理计划下使用，将被害虫迅速产生的抗性所淘汰。为了更好地利用苏云 金芽胞杆菌icps,延缓害虫的抗性必须在植物基因工程、icps的作用机理和昆 虫生态学等领域继续深入研究，科学制定抗性治理计划。另外，为了成功地执 行抗性治理计划，必须注意以下两点：1对抗性进行科学的评估和监测，并根据 田间害虫发生情况和抗性监测的调查结果适时调整计划。2抗性治理计划必须普 遍和系统地执行。一方面

48、要有合适的政府机构进行监督；另一方面要增强宣传 和教育，使种植者意识到抗性治理的重要性而愿意配合政府执行计划。如果不 能普遍按要求执行计划，则一地产生的抗性害虫将扩散到附近，其至一国的抗 性害虫扩散到邻国而引起整个计划的失败。2转bt基因的性状变异不少文献报道了转基因植物会产生一系列性状变异。有人报道了转基因水稻 表现岀植株变小，花期推迟，育性降低等变异。有人发现转基因水稻在温室及 田间条件下对比，转基因水稻株高、单株粒重、百粒重和结实率等方面都有下 降，而单株有效分菓数增多，生长进程推迟，落粒性增强。转基因植物性状除了由无性变异引起外，还由于外源基因的导入破坏了受体基因的活性，影响了 受体植

49、物的代谢过程，使表型发生了改变，所以进行转bt基因育种时，根拯育 种目标，选择优良且具较强杀虫活性的转基因植物，对于创造优良性状的抗虫 植物至关重要。转bt杀虫晶体蛋白基因植物的出现已经成为现代农业发展开创了一个新时 代，但它仅仅是增加产量带来了持续农业、保护生态环境的一个开端，将来必 须注重bt转基因植物与传统农业相结合的深入研究，解决bt转基因植物的存在 问题，使之更好地服务于人类。3转bt杀虫晶体蛋白基因的沉默目前，限制转基因植物向实用化、商品化发展的另一个重要因素是转基因的 沉默现象。转基因的沉默与转基因在受体植物中甲基化状况，转基因的拷贝数, 插入受体植物染色体位点及转基因是否与受体

50、植物中有同源基因等因素有关。 目前人们主要采取以下方法来减少转基因的沉默。a：改进转基因方法如采用基 于ac/ds转座系统建立的转化载体，构建核基质支架附着区载体，利用噬菌体 位点特异性重组系统，利用酵母线粒体isec i同源重组系统，以及双元细菌， 人造染色体载体系统，尽量避免多拷贝外源基因整合到受体基因组中，b在有性 世代后代中，筛选单拷贝转基因个体。c采用具有特殊功能的启动子和增强子进 行调控。d继续渗入研究dna的空间结构，各种调控引子，以及环境和发育引 自对转基因的影响，至于人们常用的去甲基化试剂s-氮胞甘，据笔者经验其施 用价值不高，原因是5氮胞苛价格高，且有致癌之嫌，虽然用它处理

51、可使10% 的转cryla (d)基因沉默水稻恢复表达活性，但恢复活性的转基因水稻普遍出 现矮化，结实率低或不育等现象，今后随着研究的不断深入，转基因沉默现象 必须会得到最终的克服。4转bt基因植物潜在生态风险性近来，有关转基因植物的商品化是否会导致严重的环境问题已经引起各方激 烈的辩论，各方主要涉及的问题是转基因植物的广泛种植与传播是否会加速杂 草及抗药性昆虫的进化，许多研究资料表明经遗传改良植物的商品化会导致编 码有利性状的转基因转移到这些植物的野生种和近缘种，allzson等认为bt杀虫 品体蛋白植物产生的最严重的生态危机。而且转基因植物中存在的生态风险性, 有关转bt杀虫晶体蛋白基因植

52、物潜在的生态危险性，已引起生态学家、生物学 家和化学家的密切关注，这方面的研究热点，世界各国相继制定颁布了一系列 生物遗传工程体及其产品安全性评价条例，对转基因植物的安全性评价制定严 格的评价标准。国务院2001年5月颁布了农业转基因生物安全管理条例， 附文后。有关转基因植物对生态环境和食物安全性影响已经进行了不少研究， 积累了一大批有价值的资料。从目前已得到的商品化的转bt基因植物来看，还没有关于转bt杀虫品体蛋白基因植物对生态环境产生危险性报道。但是转bt 基因植物的潜在危险性必须引起重视。转基因生物存在一定的生态风险性，也许这可能成为中国加入wto后中国政府 调控市场的微调控制器。附中国

53、农网2002年1月22日：转基因细则可能会在一定程度上抑制今年我国 玉米的进口备受市场关注的农业转基因生物安全管理条例实施细则终于在元月7日 在千呼万唤中出来了，立即在国内外粮油市场引起惊涛拍岸，平地卷起千堆雪。 大连大豆期货连续两天涨停板，cb0t大豆也随之强劲反弹。转基因细则规定，对华出口农产品的海外公司必须从农业部获得安全证 书，以证实这些产品对人、动物以及环境无害。此外，必须在签署合同前就已 经获得该证书。所有进口的转基因大豆、玉米、油菜籽、棉籽以及西红柿都必 须清楚的标识为转基因产品。对细则进行研读之后，细则秉承着基本精神并不 是拒绝进口，而是一种出于安全性的考虑而进行更加完善细致的检验、检疫。 基于这一点，笔者认为从3月20日正式实施转基因细则之后，我国今年玉 米的进口，将会出现放缓速率的现象，但速率放缓并不等于今年绝对进口数量 会减少。2002年是我国入世后的第一年，按照入世承诺，我国要降低玉米进口关税, 国家必须安排一定配额的玉米进口，玉米进口配额内关税有四档，即：0%、1%、 9%、35%,今年我国将以1%低进口关税安排450万吨的配额。农业转基因生物安全管理条例实施细则，将在一定程度上限制进口，使 进口成本提高