临床微生物学概论

1、 临床微生物学概论临床微生物学概论（第一部分）（第一部分）复旦大学附属华山医院抗生素研究所复旦大学附属华山医院抗生素研究所2n标本采集n细菌的分离培养和鉴定n抗菌药物敏感性试验主要内容主要内容3正常菌群正常菌群 n在正常人体体表与外界相通的腔道：口腔、鼻咽腔、肠道、泌尿生殖道存在的多种微生物。n在机体免疫功能正常时对人体有益无害，属人类正常微生物群或环境中通常不致病的微生物，因以细菌和真菌为主，故称“正常菌群”。n正常菌群的存在是保持人体健康的重要因素n反映出在正常情况下，宿主、正常菌群和外界环境相互适应，保持平衡状态。45病原微生物病原微生物n病原微生物病原微生物(pathogen)： 引起

2、人类感染性疾病的微生物称为病原微生物病原微生物或致病微生物致病微生物。l细菌：如痢疾志贺菌、肠杆菌科细菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌属等l病毒：如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒等l真菌：如念珠菌属、曲霉属、毛霉属以及新型隐球菌等l其他：如支原体、衣原体、螺旋体6临床常见的病原微生物临床常见的病原微生物n革兰阳性菌：革兰阳性菌：l葡萄球菌、溶血性链球菌、肠球菌n革兰阴性菌：革兰阴性菌：l需氧球菌： 脑膜炎和淋病奈瑟球菌、卡他莫拉菌l需氧杆菌： 不动杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、嗜血杆菌l需氧和兼性厌氧：肠杆菌科细菌如大肠杆菌、肺杆、伤寒、志贺菌。l厌氧细菌：脆弱拟杆菌、痤疮丙酸杆菌等7苛苛 养养

3、 菌菌n定义：是一类生长需要特殊营养物质的细菌，与许多感染性疾病有关，其分离培养较为困难。n营养要求高l肺炎链球菌：培养基内要加入血或血清l流感嗜血杆菌：X、V因子n比较娇嫩、对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱。n培养条件：510CO2、35培养、24 48hn呼吸道其他快生长细菌的覆盖使分离率非常低8厌厌 氧氧 菌菌n是一群专性厌氧，必须在无氧环境下才能生长繁殖的细菌。n根据能否形成芽胞，可将厌氧菌分成两大类。l厌氧芽胞梭菌属l无芽胞厌氧菌n厌氧芽胞梭菌属：破伤风梭菌、产气荚膜杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌n无芽胞厌氧菌：拟杆菌属、梭杆菌属、丙酸杆菌属、消化链球菌属等9标本的采集标本的采集n抗菌药使用前

4、n正确的部位n正确的时间n足够的数量n无菌的容器n特殊要求应在化验单上注明10主要的临床标本种类主要的临床标本种类标本类型标本类型n呼吸道标本l深部咳出痰、支气管灌洗液l咽拭子、鼻气管吸出液、气管吸出液n尿液 n血液 n脑脊液n伤口、脓液n其它体液l胸水、心包液、引流液、腹水、滑囊液11标本的处理标本的处理n涂片光镜检查l诊断病原最基本和快速的方法：脑脊液l直接形态学检查l革兰染色或特殊染色n分离培养和鉴定n动物接种n免疫学检查12痰标本痰标本主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。假

5、单胞菌。非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌病人需用水清洁口腔，深咳肺部痰，不要唾液#1进行革兰染色以评价标本是否适于接种。向临床医生尽快报告重要的革兰染色结果#2#3好：很少扁平上皮细胞奥普托欣纸片CO2中孵育48小时#4接种巧克力平皿，血平皿和麦康凯平皿#5拒绝：大量 扁平上皮细胞肺炎克雷伯菌对重要病原菌进行鉴定&药敏试验金黄色葡萄球菌肺炎链球菌胆汁溶菌奥普托欣流感嗜血杆菌13革兰染色评估呼吸道标本是否合格？革兰染色评估呼吸道标本是否合格？有代表性的好标本有代表性的好标本中性粒细胞多中性粒细胞多白细胞25/低倍视野鳞状

6、上皮细胞少鳞状上皮细胞少 10/低倍视野14痰标本痰标本10鳞状上皮细胞鳞状上皮细胞/每低倍视野每低倍视野=拒收拒收19#1bab尿培养尿培养主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其他主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其他革兰阴性杆菌，肠球菌，腐生葡萄球菌，纯的金葡球菌革兰阴性杆菌，肠球菌，腐生葡萄球菌，纯的金葡球菌#2接种血平皿和麦康凯平皿#3空气孵育空气孵育24小时小时收集中段尿收集中段尿a#4菌落计数菌落计数0.001ml接种环接种环 尿尿培培养养的的评评估估标标准准 病病人人 标标本本类类型型 有有意意义义的的病病原原菌菌 C CF FU U/ /m ml l 无无症症

7、状状 清清洁洁留留取取或或留留置置管管留留取取 1 10 00 0, ,0 00 00 0 有有症症状状但但不不需需卧卧床床 清清洁洁留留取取 1 1- -2 2 种种病病原原菌菌。 2 2 种种视视为为污污染染 有有症症状状，性性生生活活活活跃跃的的女女性性 清清洁洁留留取取 1 10 00 0 纯纯培培养养的的肠肠杆杆菌菌科科菌菌 男男性性 清清洁洁留留取取 1 10 00 00 0 潜潜在在病病原原菌菌 所所有有 从从导导尿尿管管中中直直接接留留取取 1 10 00 0 个个所所有有种种类类的的潜潜在在病病原原菌菌 所所有有 外外科科或或膀膀胱胱吸吸取取 任任何何数数量量（肉肉汤汤增增菌

8、菌，厌厌氧氧菌菌） 所所有有 有有争争议议 任任何何酵酵母母菌菌 若若 2 种菌生长，对种菌生长，对每种菌进行鉴定和药每种菌进行鉴定和药敏试验；敏试验；若若2种菌生长，报种菌生长，报告告“混合菌群混合菌群”#5注意注意: 革兰阴性杆菌在血平革兰阴性杆菌在血平皿和麦皿和麦 康凯平皿上均康凯平皿上均生长良好生长良好革兰阳性球菌仅在血革兰阳性球菌仅在血平皿上生长良好平皿上生长良好GNR#675,000 cfu/ml50,000 cfu/ml100,000 cfu/mlGPC20脓，吸取物或组织标本脓，吸取物或组织标本主要病原菌：金葡菌，化脓链球菌，其他主要病原菌：金葡菌，化脓链球菌，其他溶血链球菌，

9、绿脓，其他革兰阴性杆菌。溶血链球菌，绿脓，其他革兰阴性杆菌。非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌用酒精消毒伤口周围皮肤用酒精消毒伤口周围皮肤最好的标本是吸取物和组织最好的标本是吸取物和组织最差的标本是拭子最差的标本是拭子#1接种血平皿和麦康凯平皿接种血平皿和麦康凯平皿如果是吸取物或组织，进如果是吸取物或组织，进行革兰染色，将重要结果通行革兰染色，将重要结果通知临床医生知临床医生#2#3铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌中孵育中孵育48小时小时#4对对1或或2种种重要病原菌进行鉴定重要病原菌进行鉴定&药药敏试验敏试验金黄色葡萄球菌

10、为主金黄色葡萄球菌为主溶血链球菌溶血链球菌肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌混合的混合的2种肠道革兰阴性杆菌：种肠道革兰阴性杆菌：2种均报种均报告；告；当检出当检出3种或更多病原菌时，报告种或更多病原菌时，报告“混合菌丛混合菌丛”并描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠并描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠道革兰阴性杆菌等。道革兰阴性杆菌等。#521血培养血培养主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金葡菌、肺链、流感主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金葡菌、肺链、流感以下菌应视为非病原菌以下菌应视为非病原菌(除非除非1次血培养分离出次血培养分离出)： 芽孢杆菌属、凝固酶阴性

11、葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌芽孢杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌从两个独立的皮肤位点采血，每瓶从两个独立的皮肤位点采血，每瓶采集采集10ml#135 自动化仪器中孵育自动化仪器中孵育5天天每天检查浊度并翻转培养瓶每天检查浊度并翻转培养瓶#2#318小时后传进行次代培养小时后传进行次代培养当培养瓶显示细菌生长时进当培养瓶显示细菌生长时进行革兰染色和传代培养行革兰染色和传代培养革兰阳性球菌革兰阳性球菌接种血接种血平皿奥普托欣试验平皿奥普托欣试验革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌接种血平皿和接种血平皿和麦康凯平皿麦康凯平皿革兰阴性双球菌或球杆革兰阴性双球菌或球杆菌菌接种巧

12、克力平皿和接种巧克力平皿和血平皿血平皿CO2中孵育中孵育72h#5#4将重要的革将重要的革兰染色结果兰染色结果尽快通知临尽快通知临床医生床医生对重要病原菌对重要病原菌进行鉴定进行鉴定和药敏试验和药敏试验#6例如：肺炎克雷伯菌例如：肺炎克雷伯菌例如：肺炎链球菌例如：肺炎链球菌22细菌的分离培养细菌的分离培养标本类型标本类型5%脱纤维脱纤维羊血平皿羊血平皿巧克力巧克力 平皿平皿中国兰中国兰平皿平皿血培养瓶血培养瓶厌氧厌氧培养瓶培养瓶呼吸道标本尿液标本（菌落计数）血液标本其他无菌体腔标本23细菌的分离培养细菌的分离培养n按实验室常规接种于培养基n培养条件：l35 24-48小时或l5%-10% CO

13、2 35 24 - 48小时l厌氧培养28具有特殊性状的细菌具有特殊性状的细菌葡萄球菌铜绿假单胞菌溶血性链球菌29具有特殊性状的细菌具有特殊性状的细菌矛头状自溶现象芽胞30细菌的鉴定细菌的鉴定n表型分类法l以细菌的形态、结构、生理、生化和血清学反应等细菌的表型为主要依据n分子生物学技术l基因诊断依据分析DNA的碱基组成，基因片段的大小，与比较DNA的同源性关系，从而分析 细菌DNA的亲缘关系。31流感嗜血杆菌的卫星现象流感嗜血杆菌的卫星现象32菌种鉴定菌种鉴定鉴定到种鉴定到种n根据纯分细菌的形态、菌落特征，特征性的生化反应，选择合适的细菌鉴定系统。n如手工的API条和半自动的ATBl肠杆菌科细

14、菌：API 20El非发酵革兰阴性杆菌：API 20NEl葡萄球菌属：Slidex Staph Plus、API Staphl链球菌属：Slidex Strepto Kit、API Strepl奈瑟菌属、嗜血杆菌属：API NHl厌氧菌：API 20A33菌种鉴定菌种鉴定鉴定到种鉴定到种n自动细菌鉴定/药敏仪lVITEK 2 CompactlBD Phoenix System lMicroScanlBIOMIC V3微生物鉴定系统lBIOFOSUN微生物鉴定系统n鉴定到种l葡萄球菌？l金黄色葡萄球菌！ 细菌鉴定和药敏试验快速化是未来的趋势细菌鉴定和药敏试验快速化是未来的趋势张嵘教授课件内容张嵘

15、教授课件内容张嵘教授课件内容张嵘教授课件内容CTX-M-14（+）生理盐水头孢噻肟CTX-M-14（-）质谱检测黏菌素耐药鲍曼不动杆菌质谱检测黏菌素耐药鲍曼不动杆菌Clinical Infectious Diseases 2015; 60(9):1295303敏感株耐药株张嵘教授课件内容39抗菌药物敏感性试验40抗菌药物和药敏试验抗菌药物和药敏试验n抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。前者是真菌、放线菌、细菌等的代谢产物，后者是经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物。n测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为药物敏感性试验（Antimicrobial Sus

16、ceptibility Testing, AST），简称药敏试验。41抗菌药物敏感性试验的意义抗菌药物敏感性试验的意义n无法推测敏感或耐药n病人个体化治疗指南n提供经验治疗的依据n建立当地或国家处方政策n监测流行病学趋势n监测细菌耐药性n测试新抗菌药物的抗菌活性 n检测新耐药机制的方法42抗菌药物敏感性试验分类抗菌药物敏感性试验分类n定量方法 (MIC, mg/L)l琼脂稀释法l肉汤稀释法lE-testn定性方法 (SIR)l纸片扩散法n自动化仪器稀释法的定义稀释法的定义n以一定浓度的抗菌药与含有被试菌株的培养基进行一系列对倍数稀释，经培养后肉眼观察未见细菌生长管内所含的最低药物浓度为该药对该

17、试验菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)n稀释法的最大优点是可以精确测得药物最低抑菌浓度，但需耗费较多材料、人力和时间。 稀释法的分类稀释法的分类n稀释法药敏试验因介质不同可分为液体稀释法和琼脂稀释法。n因容器不同分为试管稀释法和微量稀释法，或称常量法和微量。l前者使用无菌的13mm100 mm试管，每一浓度抗菌药的量至少为1ml；l后者使用812的U型底小孔的微量稀释板，小孔内装有0.1ml肉汤。n琼脂稀释法又因在平皿中进行而称为平皿稀释法。n微量稀释法的优点为试剂材料较节省，而且微量板中可预先配制好抗菌药和培养基，冷藏后一定时期内使

18、用，较为方便。n与试管稀释法相比，琼脂稀释法配合多点接种器使用，可同时进行大量菌株的药敏试验，实验结果重复性好，缺点是不能进行最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration, MBC)的测定。与稀释法药敏试验有关的指标有哪些？与稀释法药敏试验有关的指标有哪些？ nMIC：l最低抑菌浓度nMBC：l最低杀菌浓度nMIC50：l抑制50%受试菌株的MIC值nMIC90：l抑制90%受试菌株的MIC值nMBC50：l杀死50%受试菌株的MBC值nMBC90：l杀死90%受试菌株的MBC值药物浓度药物浓度菌株数菌株数累积菌株数累积菌株数MIC50MIC900.125

19、110.25230.514104226242882108琼脂稀释法琼脂稀释法n琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多点接种器接种细菌。n经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度为最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC ）n试验菌的结果报告可用MIC（ug/ml ）或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。816多点接种仪多点接种仪试管稀释法试管稀释法试管稀释法试管稀释法0.060.1250.250.512481632MIC1ug/ml微量稀释法微量稀释法0.060.1250.250.51248

20、163264128ABCDEFGH微量稀释法微量稀释法微量稀释法结果阅读微量稀释法结果阅读E-试验试验E试验原理试验原理nE试条（E-test）是一条 5mm50mm的无孔试剂载体，一 面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。n将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物对细菌的最低抑菌浓度（MIC）结果判断和报告结果判断和报告读取椭圆抑菌环与E试验试条的交界点刻度值E-试验结果阅读试验结果阅读纸片扩散法纸片扩散法58纸片扩散法原理纸片扩散法原理n将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌

21、的琼脂平板上n纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度n在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。59纸片扩散法结果图纸片扩散法结果图60规范化的药敏试验方法规范化的药敏试验方法-扩散法扩散法(纸片法纸片法) 原理：原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，因此敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，根据抑菌圈的大小即可推知该药物的最低抑菌浓度（MIC）。61如何正确挑取细菌？如何正确挑取细菌？ 62正确的接种菌量正确的接种菌量n扩散法：0.5麦氏浊度（1.5108CFU/ml）Se

22、lect coloniesPrepare inoculumsuspension63充分混匀充分混匀标准浊度标准浊度菌苔厚度的要求 Clin Microbiol Infect 2014; 20: O831O839J Antimicrob Chemother, 2010; 65: 249-251接种菌量升高导致MIC升高接种菌量升高导致改良Hodge试验假阳性升高DMID,2004; 49: 41-46.67合适的培养基厚度合适的培养基厚度n普通细菌lMH琼脂培养基（MuellerHinton Agar）l培养基厚度：4mmn肺炎链球菌及其他链球菌l5脱纤维羊血MH琼脂培养基n嗜血杆菌属l嗜血杆菌

23、培养基（HTM）SR158添加剂错误做法：错误做法：采用血琼脂做肠球菌的药敏试验采用血琼脂做肠球菌的药敏试验684.合适的培养条件合适的培养条件n需氧菌： 35 2 ，16-18小时l嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌：20-24小时l葡萄球菌：33-35 ，苯唑西林、万古霉素 24小时l肠球菌：万古霉素-24小时l溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时695.正确阅读结果（纸片法）正确阅读结果（纸片法）n工具：游标卡尺，尺子n光源：反射光、透射光n阅读： 药敏平皿背衬不反光的黑色背景用l肉眼观察l也可用机器阅读抑菌圈直径n抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下才能观察到的细小菌

24、落应忽略70正确测量苯唑西林、万古霉素和利奈唑胺对葡正确测量苯唑西林、万古霉素和利奈唑胺对葡萄球菌；以及万古霉素对肠球菌的抑菌圈直径萄球菌；以及万古霉素对肠球菌的抑菌圈直径透射光透射光反射光反射光不要用反射光不要用反射光要使用透射光要使用透射光抑菌圈内有菌落，怎么办？大肠埃希菌污染有肠球菌大肠埃希菌污染有肠球菌菌落再次纯分菌落再次纯分铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌有耐药菌落有耐药菌落73CLSI文件：我国部颁标准文件：我国部颁标准74结果判断和报告：纸片扩散法结果判断和报告：纸片扩散法 1 1株细菌株细菌1 1个药个药1 1个标准个标准n 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。n通常采用CLSI

25、公布的药敏结果判断标准，采用三级划分制。l临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI l是我国的部颁标准肠杆菌科细菌判断标准肠杆菌科细菌判断标准结果判断和报告：稀释法结果判断和报告：稀释法 1 1株细菌株细菌1 1个药个药1 1个标准个标准76结果判断和报告结果判断和报告n敏感（敏感（Susceptible）：）：当一种细菌引起的感染，用某种药物常规量治疗有效，这种细菌即对该药高度敏感。n中度敏感（中度敏感（Intermediate）：）：当细菌引起的感染仅在应用高剂量抗菌药物时有效，或者细菌处于体内抗菌药物浓缩的部位

26、或体液（如尿、胆汁、肠腔等）中时才被抑制，这种细菌对该药仅呈中度敏感。n耐药（耐药（Resistance）：）：药物对某一细菌的药敏高于药物在血或体液内可能达到的浓度时，有时细菌能产生灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，仍应判定该菌为耐药。例如产青霉素酶的金葡菌即应认为该菌对青霉素耐药。776.重要的质控菌重要的质控菌n肠杆菌科细菌：大肠埃希菌ATCC25922n非发酵菌： 铜绿假单胞菌ATCC27853n葡萄球菌： 金黄色葡萄球菌ATCC25923n肠球菌： 粪肠球菌ATCC29212n肺炎链球菌： 肺炎链球菌ATCC49619n嗜血杆菌： 流感嗜血杆菌ATCC49247 78改变条

27、件对于质控的要求改变条件对于质控的要求要求质控的连续天数要求质控的连续天数方法改变方法改变1520或30药敏纸片药敏纸片 更换新的批号 更换新的厂家 更换新的品种培养基培养基（配置药敏平板） 更换新的批号 更换新的厂家79改变条件对于质控的要求改变条件对于质控的要求要求质控的连续天数要求质控的连续天数方法改变方法改变1520或30接种物准备接种物准备 校准更换的使用设备 校准操作者技术测量抑菌圈测量抑菌圈 方法改变仪器仪器/软件软件 软件的更新 仪器的修理80纸片法药敏试验结果异常分析纸片法药敏试验结果异常分析81天然耐药天然耐药82（二）正确的抗菌药物组合（二）正确的抗菌药物组合原则：针对监

28、测细菌设计监测药物的品种和数量nCLSI抗菌药物选择的原则（抗菌药物选择的原则（A、B、C、U组）组）n根据病原菌的种类根据病原菌的种类l革兰阳性球菌u葡萄球菌、肠球菌 、链球菌等l革兰阴性杆菌u肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌等n根据本单位临床实际需要根据本单位临床实际需要83FDA批准临床微生物室常规药敏试验分组批准临床微生物室常规药敏试验分组抗菌药：抗菌药：A .为常规的一级(一线)试验组合并常规报告结果B. 亦可用于一级(一线)试验，但应选择性报告，即当A组药物耐药时可以选择性地报告B组中的同类药物C. 为补充性药物，可选择性报告U. 为补充性药物,仅用于治疗尿路感染的选择用药84补充性药物选择性报告的原则补充性药物选择性报告的原则n对一线试验组合的药物耐药n身体特殊部位n患者不能接受一线试验组合的药物n一线试验组合的药物对患者无效n复数菌感染n多部位感染85肠杆菌科细菌的抗菌药物选择肠杆菌科细菌的抗菌药物选择抗菌药物抗菌药物ABCU抗菌药物抗菌药物ABCUO