Phagedisplaytechnology(1)

1、Phage display technologyPhage display technologyMember： Tengfei Ma Yangyang Ma Chenri Wang Shuhu Liu1234噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术的步骤噬菌体展示技术优缺点噬菌体展示技术噬菌体展示技术的概念5噬菌体展示技术的应用Ph.D.概念v噬菌体展示噬菌体展示技术技术(phage display technology) 是将外源蛋白或多肽的是将外源蛋白或多肽的DNA序列序列插入到插入到噬菌体噬菌体外外 壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳 蛋白的表

2、达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的 重新组装而展示到重新组装而展示到噬菌体噬菌体表面的生物技术。表面的生物技术。Ph.D.原理v将将多肽多肽或蛋白质的编码基因或或蛋白质的编码基因或目的基因目的基因片段克隆入片段克隆入噬噬菌体菌体外壳蛋白外壳蛋白结构基因结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋的适当位置，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白白与外壳蛋白融合表达融合表达，融合蛋白融合蛋白随子代噬菌体的重随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。保持相对独立的空间结新组装而展示在噬菌体表面。保持相对独立的空间结构和构和生物活性生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与，以利

3、于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞宿主细胞后后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮轮5轮的轮的“吸附吸附-洗脱洗脱-扩增扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。得到高度富集。展示系统 Display System噬菌体展示系统的分类Classification of pha

4、ge display systemsPh.D.步骤v以以单克隆抗体单克隆抗体筛选蛋白质抗原表位为例筛选蛋白质抗原表位为例 将单抗包被聚乙烯平皿后，再加入噬菌体展示肽将单抗包被聚乙烯平皿后，再加入噬菌体展示肽库，使其充分与单抗反应后，洗去未结合的游离库，使其充分与单抗反应后，洗去未结合的游离噬菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下噬菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下来。将其浸染宿主大肠杆菌扩增后回收，再进行来。将其浸染宿主大肠杆菌扩增后回收，再进行下一轮筛选。通常经过下一轮筛选。通常经过3、4轮的筛选，并且每次轮的筛选，并且每次增加筛选强度，这样就可获得与单抗结合较紧密增加筛选强度，这样

5、就可获得与单抗结合较紧密的噬菌体克隆。通过序列测定和分析，就能推知的噬菌体克隆。通过序列测定和分析，就能推知该噬菌体克隆所携带的外源短肽序列，从而确定该噬菌体克隆所携带的外源短肽序列，从而确定该单抗所针对的抗原表位。该单抗所针对的抗原表位。Ph.D.优点vA.高通量的高通量的淘选淘选将靶标分子（抗体）固定在固相将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入载体上，加入噬菌体展示噬菌体展示肽库（肽库（噬菌体噬菌体的数量可的数量可达达1011 PFU），利用抗原），利用抗原-抗体的特异性亲和抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，不力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体

6、仍在溶液中，可以通过洗涤去除，能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的扩增、淘选，即可将有用的基因基因从多达百万以上从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。的噬菌体克隆中分离出来。vB.可用于模拟可用于模拟表位表位的筛选利用噬菌体展示技术得的筛选利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多（到模拟表位的报道较多（Giuseppe, 2001；Seshi et al., 2002；Ouyang et al., 2003）。李全喜等（）。李全喜等（1997）利用单抗）利用单抗9E10筛筛选选噬

7、菌体噬菌体随机肽库，结果获得了两个随机肽库，结果获得了两个阳性克隆阳性克隆，其中一个与抗原天然序列同源，而另一个则完全其中一个与抗原天然序列同源，而另一个则完全不同（即为模拟表位）。模拟表位同样可诱发与不同（即为模拟表位）。模拟表位同样可诱发与天然表位相似的天然表位相似的特异性免疫特异性免疫反应，例如利用乙肝反应，例如利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高滴度滴度的乙的乙肝病毒抗体。肝病毒抗体。vC.易于纯化重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求易于纯化重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，在一般的实验室条件下就可昂贵的试剂与设备，在一般的实验室条件

8、下就可以完成。用于鉴定表位和受体所用的以完成。用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体噬菌体载体为为13单链噬菌体单链噬菌体。由于。由于M13噬菌体噬菌体是温和型噬是温和型噬菌体，不裂解菌体，不裂解宿主宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，通过离心收集培养上清，再向其中加入养基中，通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂沉淀剂即可将上清中大量噬菌体粒子沉淀下来，即可将上清中大量噬菌体粒子沉淀下来，从而富集得到含外源从而富集得到含外源基因产物基因产物的重组噬菌体。的重组噬菌体。Ph.D.缺点v首先，所建的肽库容量只能达到首先，所建的肽库容量只能达到109，要想构建，要想构建大片段的肽库很困难。大片段的肽库很困难。v其次，需要解决肽库的多样性问题。其次，需要解决肽库的多样性问题。v第三，少数多肽由于第三，少数多肽由于疏水性疏水性过强，或由于影响过强，或由于影响外外膜蛋白膜蛋白的折叠而不能展示在的折叠而不能展示在噬菌体噬菌体表面。表面。Ph.D.应用1.