菠菜actin基因片段的克隆

1、菠菜菠菜actin基因片段的克隆基因片段的克隆l植物基因组植物基因组DNADNA提取提取lDNADNA的的PCRPCR扩增及其产物回收扩增及其产物回收lDNADNA与载体的与载体的连接连接和和转化转化是是基因工程基因工程中最基本的操作技术中最基本的操作技术主要包括以下实验技术：主要包括以下实验技术：基因工程基因工程狭义：狭义：人工创造人工创造DNADNA分子新组合的技术（即分子新组合的技术（即重组重组DNADNA技术技术）广义：广义：重组重组DNADNA技术及其产业化设计和应用，包技术及其产业化设计和应用，包括括上游技术上游技术和和下游技术下游技术两大部分。两大部分。上游技术上游技术是是指重组

2、指重组DNADNA技术；技术；下游技术下游技术则涉及到基因工程菌则涉及到基因工程菌或基因工程细胞的大规模或基因工程细胞的大规模培养培养以及基因表达产以及基因表达产物的物的分离和纯化分离和纯化，动、植物，动、植物转基因转基因等等DNADNA重组重组微生物发酵微生物发酵分离、提纯分离、提纯产品产品生物反应器生物反应器狭义转基因广义广义+ +提取提取DNADNA筛选文库筛选文库/ /PCRPCR连接连接载体载体细胞细胞DNADNA载体载体重组载体重组载体宿主宿主扩增（基因）扩增（基因）酶切酶切基因基因基因基因转化转化+ +上上游游技技术术下游下游为基因测序和其它研究和应用准备高质量的基因片段为基因测

3、序和其它研究和应用准备高质量的基因片段。Your TextYour TextYour TextPCR及及检测检测连接连接转化转化筛选筛选实验流程及原理Your Text回收回收鉴定鉴定Your Text测序测序DNA提取提取及检测及检测产物回产物回收等收等引物引物.5-3-3-5 引物设计引物设计正向引物正向引物( (Forward)反向引物反向引物( (Reverse) )正向引物：正向引物：TCATTCTCTGATCCGTGCAG1.1.对引物的一般要求对引物的一般要求 (1) 长度一般为长度一般为 18-27 nt (2) GC 含量为含量为 40-60% (3) 引物在模板内没有其它高

4、度相似的序列引物在模板内没有其它高度相似的序列 (4) 引物间和引物内不形成二聚体及发夹结构引物间和引物内不形成二聚体及发夹结构 (5) 引物之间的引物之间的Tm值应基本相同（值应基本相同（ Tm估计值与计算方法有关）估计值与计算方法有关） (6) 3端避免出现端避免出现3个及以上连续的相同碱基个及以上连续的相同碱基反向引物：反向引物：AGGCAAGCTTTTCCTTCACA3.3.引物设计工具引物设计工具（1）引物设计软件 Oligo 6.44 Primer Premier 5.0 Dnastar（2）网上引物设计工具 Primer3 /prime

5、r3/input.htm2. DNA序列的来源序列的来源 （1）查询序列数据库 （2）查阅科技文献 （3）测序The National Center for Biotechnology Information （）例例1 1：查询查询Spinacia oleracea actin gene序列序列2021-11-22/primer3/input.htm例例2 2：利用利用Primer3设计引物设计引物 复制和粘贴复制和粘贴DNADNA序列序列 勾选所需的引物勾选所需的引物 获取引物获取引物 连接连接

6、 Taq酶能够在酶能够在PCR产物的产物的3 末端加上一个非模板依赖的末端加上一个非模板依赖的A； T载体是一种带有载体是一种带有3 T突出端的载体；突出端的载体； 在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。）中。高效克隆高效克隆PCR产物（产物（TA Cloning）的专用载体）的专用载体 转化转化细胞经过一些特殊方法如电击法细胞经过一些特殊方法如电击法, 化学试剂法（化学试剂法（CaCl2)等的处理后等的处理后,细胞膜细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外

7、源的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的分子进入的感受态细胞感受态细胞。3 3、鉴定、鉴定- -互补互补质粒载体质粒载体带有一个大肠杆菌的带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的）的调控序列和前调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能。而不影响功能。宿主细胞宿主细胞存在可编码存在可编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分的序列。端部分的序列。它们同时存在时，能恢复它们同时存在时，能恢复lacZ酶的活性，称为酶的活性，称为-互补。互补。在诱导剂在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生存在时产生蓝色菌落蓝色菌落，因而易于识别。，因而易于识别。当外源当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成端片段，使得带有重组质粒的细菌形