(完整版)SDS-PAGE凝胶电泳技术(原版)

1、 sds- sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-polyacrylamide gel electrophoresis sds-page食品科学食品科学 王玲华王玲华一、什么是一、什么是sdssds十二烷基硫酸钠一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。sdssds的作用的作用 破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质解聚而改变原有的构象，保证解聚后的蛋白质分子与sds充分结合而形成带负电荷的蛋白质-sds复合物。二、二、sds-pagesds-page的基本原理的基本原理（一）蛋白质分子的解聚（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入

2、阴离子去污剂样品介质和聚丙烯酰胺中加入阴离子去污剂sdssds和强还和强还原剂后，蛋白质分子解聚，与原剂后，蛋白质分子解聚，与sdssds结合形成带负电荷的蛋结合形成带负电荷的蛋白质白质-sds-sds复合物，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于复合物，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚亚基分子量的大小基分子量的大小，而蛋白质原有电荷因素可以被忽略。，而蛋白质原有电荷因素可以被忽略。1 1、sdssds 阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂 助溶性试剂助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构破坏蛋白质分子的二级和三级结构2

3、 2、强还原剂、强还原剂 巯基乙醇（巯基乙醇（-mercaptoethanal-mercaptoethanal） 二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（dithiothreitoldithiothreitol，dttdtt） 使半胱氨酸残基之间的使半胱氨酸残基之间的二硫键二硫键断裂。断裂。蛋白质蛋白质- -sdssds复合物的特点复合物的特点：（1 1）形状像一个长椭圆棒。）形状像一个长椭圆棒。（2 2）短轴对不同的蛋白质亚基）短轴对不同的蛋白质亚基- -sdssds胶束基本上是相胶束基本上是相同的。同的。（3 3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。（4 4）所带

4、的负电荷远远超过蛋白质分子原有电荷，）所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有电荷，消除了蛋白质分子间原有电荷差异。消除了蛋白质分子间原有电荷差异。 复合物在复合物在sds-pagesds-page系统中的电泳迁移率不再受系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的取决于椭圆棒的长轴长度长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。，即蛋白质或亚基分子量的大小。 当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在1515kdkd200kd200kd之间时，之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系3 3、影响、影响sdssds电泳的关键因

5、素电泳的关键因素（1 1） 溶液中溶液中sdssds单体浓度（单体浓度（1mmol/l)1mmol/l) 大多数蛋白质与大多数蛋白质与sdssds结合的重量比为结合的重量比为1 1：1.41.4（2 2） 样品缓冲液的离子强度（不样品缓冲液的离子强度（不0.26)0.26) 低离子强度低离子强度的溶液中，的溶液中，sdssds单体才具有较高的平单体才具有较高的平衡浓度。衡浓度。（3 3） 二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原 当二硫键被当二硫键被彻底还原彻底还原后，蛋白质分子才能后，蛋白质分子才能被解聚被解聚，sdssds才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和才能定量地结合到亚基上而给出

6、相对迁移率和分子量对数的线性关系。分子量对数的线性关系。（二）缓冲系统的选择（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的phph范围，范围，凡凡不与不与sdssds发生相互作用发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。的。电泳缓冲液的种类：电泳缓冲液的种类：1 1、磷酸缓冲液、磷酸缓冲液2 2、tris-tris-醋酸钠缓冲系统醋酸钠缓冲系统3 3、咪唑缓冲液系统：、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速比磷酸缓冲系统的导电

7、性低，电泳速 度要比后者快一倍。度要比后者快一倍。4 4、尿素系统：、尿素系统： 适用分子量低于适用分子量低于1515kdkd的蛋白样品。的蛋白样品。5 5、tris-tris-甘氨酸甘氨酸系统：系统： 使用最多的缓冲液使用最多的缓冲液6 6、tris-tris-硼酸盐缓冲液：硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量测定糖蛋白的分子量（三）凝胶浓度的选择（三）凝胶浓度的选择 由于由于sdssds电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后度，只取决于分子解聚后sds-sds-蛋白质胶束的大小，蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。因此凝胶浓度

8、的选择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓不同的凝胶浓度度. .凝胶浓度与被分离蛋白质分子量大小关系如表凝胶浓度与被分离蛋白质分子量大小关系如表1 1样品分子量范围分离胶浓度（%）蛋白质10420-30（1-4）10415-204（104-105）10-15（1-5）1055-1051052-5核酸10415-20104-1055-10105-21052-2.6三、分离方法1、分类分类（1 1）根据对样品的处理方式的不同）根据对样品的处理方式的不同 还原还原sdssds电泳电泳 非还原非还原sdssds电泳电泳 带有烷基化作用的还原带有烷基化

9、作用的还原sdssds电泳电泳（2 2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同 连续电泳连续电泳 不连续电泳不连续电泳（3 3）根据电泳的形式）根据电泳的形式 圆盘电泳圆盘电泳 垂直电泳垂直电泳 平板电泳平板电泳 水平电泳水平电泳2 2、操作要点、操作要点（1 1）制备凝胶）制备凝胶丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂n,n-n,n-甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（bisbis）在催化）在催化剂的作用下聚合。剂的作用下聚合。 过硫酸铵和四甲基乙二胺（化学聚合催化剂）过硫酸铵和四甲基乙二胺（化学聚合催化剂）催化剂催化剂 核黄素（光聚合的催化剂核黄素（光聚合的催化剂不连续电泳使用不

10、同孔径的凝胶，使用不同的不连续电泳使用不同孔径的凝胶，使用不同的phph和和缓冲液。缓冲液。不连续电泳的凝胶由上至下可分为：不连续电泳的凝胶由上至下可分为： (1) (1)样品胶：大孔径凝胶，在样品胶：大孔径凝胶，在ph6.76.8ph6.76.8的的tris-tris-hclhcl中聚合，含有样品。中聚合，含有样品。 （2 2）浓缩胶：除不含样品外，其他与样品胶相）浓缩胶：除不含样品外，其他与样品胶相同。同。 （3 3）分离胶：小孔径凝胶，在）分离胶：小孔径凝胶，在ph8.88.9ph8.88.9的的tris-tris-hclhcl中聚合中聚合. .（2 2）电极缓冲液的选择）电极缓冲液的选

11、择（3 3）电泳）电泳加样后，接通电源加样后，接通电源。开始时将电流调至开始时将电流调至10ma10ma。待样品进。待样品进入分离胶时，将电流调至入分离胶时，将电流调至202030ma30ma继续电泳，直至溴酚继续电泳，直至溴酚蓝染料到达分离胶底部上方约蓝染料到达分离胶底部上方约1cm1cm时，关闭电源。拔掉固时，关闭电源。拔掉固定板，取下玻璃板，取出胶板。定板，取下玻璃板，取出胶板。（4 4）染色和脱色）染色和脱色经经sdssds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品品，浸泡在，浸泡在含0.5%0.5%氨基黑氨基黑10b10b的的7%7%醋酸染色醋酸染色体中，或浸

12、泡在含体中，或浸泡在含0.1%0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝的的12.5%-12.5%-50%50%的三氯醋酸染色液中的三氯醋酸染色液中。进行染色和蛋白进行染色和蛋白质的固定。质的固定。染色染色1 12 2小时或过夜。染色后的小时或过夜。染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，直到蛋白质区带清晰。3 3、电泳过程中的不正常现象、电泳过程中的不正常现象（1 1）“微笑微笑”现象现象 指示剂前沿呈现指示剂前沿呈现 两边向上两边向上 的曲线形，说明凝胶的的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却不均匀冷却，中间部分冷却不好。中间部分冷却不好。（2 2）“皱眉皱眉”现象现象 由于垂直电泳槽的由于垂直电泳槽的装置不合适装置不合适引起的，特别是当凝胶引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的和玻璃板组成的“三明治三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。聚合不完全。（3 3）“拖尾拖尾”现象现象 样品溶解不佳样品溶解不佳引起。引起。（4 4）偏斜现象）偏斜现象 电极放置不平行电极放置不平行