祛疣洗剂提取纯化工艺探究

1、祛疣洗剂提取纯化工艺探究作者：鞠建明钱大玮朱玲英沈红李英【摘要】：目的研究祛疣洗剂制备工艺，优选最佳提取、 纯化工艺条件。方法以密基红花黄色素a含量、含固量为检 测指标，用正交实验考察了 3种因素（加水量、煎煮时间、 煎煮次数）对其水煎煮工艺的影响；然后比较了不同的醇沉 浓度的去杂效果。结果祛疣洗剂最佳水提工艺条件为加12 倍量水，煎煮2次，1 h/次；去杂工艺以60%醇沉为佳。结 论制备工艺合理。【关键词】祛疣洗剂高效液相色谱正交实验醇沉a 基红花黄色素a祛疣洗剂是江苏省中医药研究院临床经验 方，疗效确切。该方由狼毒、红花、板蓝根等6味药组成， 具有清热解毒，杀虫除湿之功，用于治疗各种赘疣。

2、红花为 本方中主要药味，主要活性成分为释基红花黄色素a。为了 确保该制剂制备工艺的合理性，我们以務基红花黄色素a为 主要考察指标，对处方的水煎煮工艺和纯化工艺进行了优 选，确定了合理的制备工艺。1仪器与试药1. 1仪器waters高效液相色谱仪（alliance2695四元 泵及自动进样系统，996二极管阵列检测器，empower色谱 工作站）；millipore m订li-q纯水器；mettler万分之一及 百万分之一电子天平。1.2试药 務基红花黄色素a对照品（批 号：11637-200502）,由中国药品生物制品检定所提供，供含 量测定用；水为重蒸水；甲醇、乙睛为色谱纯；其他试剂均 为分

3、析纯。2方法与结果2. 1水煎煮工艺条件优选2. 1. 1正交实验设计1根据预实验，对影响水提取 工艺的主要因素（加水量、提取时间、提取次数）按4因素 3水平进行l9（34）正交实验。各因素水平安排见表1。表 1正交实验因素水平2. 1.2样品制备按处方比例称取药材145 g,分别按正 交实验表各行所列条件煎煮，滤过，合并滤液，减压浓缩 （&lt；65°c）至 2 000 mlo2. 1. 3含量测定含固量测定：精密量取样品液25 ml,水浴蒸干，1059 烘3h,取出置干燥器内冷却30 min,迅速称重。结果见表 2o释基红花黄色素a的含量测定：色谱条件2, 3：色 谱柱为

4、 alltima c18 （4. 6 mmx250 mm , 5 p m）；流动相为 甲醇-乙睛-0.5%磷酸水（26 ： 2 ： 72）；流速 1.0 ml min-1； 检测波长400 nm；柱温35°co在此条件下轻基红花黄色素a 与相邻峰达到基线分离（见图1）。对照品溶液的制备：精 密称取释基红花黄色素a对照品1.866 mg置于10 ml量瓶 中，用25%甲醇溶解并定容至刻度，即得每毫升含0. 186 6 mg 的对照品溶液。供试品溶液的制备：取正交实验样品液适 量，离心，上清液过0.45 um的微孔滤膜，即得供试品溶 液。标准曲线的制备：精密吸取龛基红花黄色素a对照品 溶

5、液1, 5, 10, 15, 20, 25 u1,注入液相色谱仪，测定其 峰面积，以进样量（ug）为横坐标，峰面积为纵坐标，得 回归方程：y=2. 55x106x-2. 20x105, r=0. 999 8o 精密 度实验：精密吸取对照品溶液10 ul,连续进样6次，峰面 积的rsd为0. 4%o供试品溶液的含量测定：精密吸取供试 品溶液10 u 1,注入液相色谱仪，依法测定，计算含量。结 果见表2o2. 1.4方差分析结果将19号实验综合评分进行方差 分析，结果见表3。表3方差分析结果2.1.5正交实验优选结果由直观分析可知，极差（r）最 大的为c因素，其次分别为b因素、a因素。说明对释基红

6、花 黄色素a及浸出物含量影响最大的为煎煮次数，其次分别为 煎煮时间、加水量，最佳组合为a3b2c2；从方差分析结果可 知：a, b, c 3因素均无统计学意义(p&gt；o. 05),选任何 水平都可以，所以以极差分析结果a3b2c2作为最佳提取工 艺，即加12倍量水，煎煮2次，煎煮lh/次。2. 1.6验证实验按优选的最佳提取工艺进行实验，测 定样品中轻基红花黄色素a的含量及浸出物含量。结果见表 4o表4工艺验证实验结果由表4可见，确定的提取工艺优 于正交实验中的任何一组，且重复性较好，说明确定的工艺 合理。2.2纯化工艺中醇沉浓度的优选2. 2. 1样品液的制备按处方比例称取药材7

7、25 g,依照 最优提取工艺进行煎煮，减压浓缩(&吐；65£)至相对密度 为1. 10 (60°c)的清膏，备用。取清膏3份，每份100 ml,分别加乙醇111, 171, 280 ml, 使乙醇浓度达50%, 60%, 70%,室温下静置48 h,抽滤，将 滤液用相应浓度乙醇定容至400 ml,备用。2. 2.2含量测定含固量测定：精密量取醇沉前药液10 ml及醇沉液50 ml, 水浴蒸干，105"烘3 h,取出置干燥器内冷却30 min,迅 速称重，计算即得。轻基红花黄色素a含量测定：精密量取醇沉前药液2 ml 置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇

8、匀，过0.45 um微 孔滤膜，得清膏供试品溶液;精密量取3种不同醇沉液2.5 ml, 置10 ml量瓶中，加相应浓度的乙醇稀释至刻度，摇匀，过 0. 45 um微孔滤膜，得醇沉供试品溶液。精密吸取各供试品 溶液20 ul,注入高效液相色谱仪，依法测定。结果见表5。 表5醇沉优选结果释基红花黄色素a含量指每毫升清膏醇沉 后所含有的務基红花黄色素a的量；去杂率(%)指除去杂 质的量占清膏含固量的百分比2. 2.3醇沉优选结果由表5可以看出，50%乙醇沉淀时 指标成分损失最大，去杂率较好，但沉淀呈泥沙状，滤过困 难，可行性较差；60%乙醇沉淀时，指标成分损失较小，去 杂效果较好，且沉淀呈絮状，静置

9、后呈块状，易滤；70%乙 醇沉淀时，指标成分损失和去杂效果均与60%醇沉接近。从 节约成本和醇沉效果方面考虑最终确定去杂工艺为60%乙醇 沉淀。3讨论文献报道4, 5,红花及以红花为主的复方多采用水为 提取溶媒，但餐基红花黄色素a的热稳定性较差，不宜长时 间加热提取、浓缩。经实验比较，5(rc温浸与热回流对红花 中務基红花黄色素a的提取效果相当，但长时间浓缩会影响 務基红花黄色素a的含量，采用减压浓缩，温度控制在659 以下，收到了较好的效果。本实验采用hplc法测定释基红花黄色素a含量的方法， 经方法学考察，具有准确、可靠、简便的特点，可作为祛疣 洗剂的含量控制方法。【参考文献】1 祝德秋，程华丰正交试验法优选排石合剂的提取 j.中成药，2003, 25(5)： 421.2 国家药典委员会中国药典，i部s 北京：化 学工业出版社,2005： 103.3 陆仙芸，林德军，徐升亮.hpl