反义RNA的原理及其应用.ppt(精)

1、反义RNA-反义RNAA( a n t i s e n sle RNA):一 种本身缺乏编码能力， 但能与特异靶RN A(主要是mR N A)互补的R NA分子，它 可通过配对碱基间氢键作用与靶R NA的特 定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶RNA的功能，从而调控基因的正常表达。基本原理-反文|RNA技术的基本原理：利用自然存在 的或人工合成的反义RNA,通过基因重组 技术反向插入到合适的表达载体形成重组-DN A,然后转染受体细胞，则这一反插二 入的序列就会随细胞周期产生大量反义R NA,对基因的表达进行调控， 从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。一、复制水平 DNA复制中的作甩一： 一一

2、反义RNA作为D|NA复制的抑制因子，与引物RN A结合或作用于引物前体而抑制DNA复制，从 而降低D N A的复制效率。Ecoli的c o I e匸 质粒复制的前提是合成适当的R NA(RNAH),它自动折叠后与DNA模板结合形成D NA复制 的引物，从复制起始点上游一4基本原理-4 5 b p处开始， 以另一D N A为模板反向转录的RN AI正好与RNA1 I的结合， 阻止了正常引物的产生， 从而 干扰复制的进行。作用机制反义R N A的作用机制主要表现在D N A复 制、转录和翻译3个水平上。二、转录水平转录及转录后水平的作用反义R NA与mlRNA 5末端互补结合，阻断帽 子结构形成

3、；作用于外显子和内含子的连接区， 二阻碍前mRNA剪接；作用于polyA形成位点， 阻碍m RN A的成熟及其向胞浆转运。在crp基 因的ticRNA (transcription i n h i bi t o r y c omp I e me n t a r y RNA)负向自我调控 中，ticRNA与erp mRNA的5端结合， 形成类似于R NA聚合酶识别的转录终止信号的 二级结构，以反式作用对转录过程本身进行调控J三、翻译水平翻译水平的作用二三三三三二二二 三反义R NA可直接与m R N A的S D序列（含R BS）或 编码区（主要是AUG）结合，从空间上直接阻止核糖 体的正帯结合或

4、可直接降解靶mR N A.反义R N A与mRNA在SD序列配对形成吻触复合体或在互补区段 结合形成R NAR N A双链结构，从而调控翻译的进 行。在真核生物细胞中有许多RNA在翻译水平上表现 反义R N A的功能。如鸡胚胎肌浆中存在的富含U的小 分子RNA称为tcRNA,它们可以与肌球蛋白重链的RN A的p o ly A尾杂交而抑制正常的翻洋过程。Audr e y等J齣研兖表明F GFAS R NA在翻译遣程能有 效地抑制FGF-2在哺乳动物细胞中的表达。反义RNA的重组DNA中只有启动子及终止子，当转染细胞后，重组DNA能自动表达反义RNA,并且重组DNA自身可以整 合到宿主的基因组D

5、NA中，或作为“附 加体”长期存在。在原核细胞中，反义R NA以针对SD序列效果最好，而在真核细胞中以5端非编码区为标靶最有效。反义RNA的应用随着基因组草图的完成，人们研究的重点己 -转向对基因功能的研究，反义核酸技术无疑 为这项宏伟的工程提供了一种有力的工具。抗病毒作用病毒是对人和动植物危害极大的病原体，然而对 病毒引起的疾病的治疗， 冃前尚无特效药物与方法C反义RNA却能特异性阻断病毒基因表达和抑制病 毒的复制出而激起许多科学工作者去探索反义R二-NA治疗病毒性疾病的有效方法。抗病毒反义R N-A技术足将特定的病毒基因反向插人到表达险载体 中，以构建反义RNA表达载体，再将重组体导人真

6、核细胞（病毒宿主细哩中表达特异性反义RNA,从-而抑制祷异有害基附的表达或抑制病毒复制。文 献报道，运用反义R N A技术己经成功地抑制疤病 毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒（H I V丄等对培 养的组织细胞的侵袭。用针对植物病毒的皮义R N A己培育出具有抗病毒能力的植物。姚志强等针对不同靶位设计了1 0段互补反义核 酸 （D NA片段）,经模型筛选发现针对S基因起始 区、SP2增施子帽区和polyA信号编码区的a sONs作用最强寻揭示反调帝基因转录/翻译起 始区的反义核酸具有明显的抗病毒作用。Gaborz?（ 1 998）使用内源性衣达抗HI V - 1po1vif和enr基氏I,以及3

7、LTR序歹ij的反义RNA方案，构建了MuVLTR启动子逆转录 病毒重组质粒，转录CD4淋巴细胞系，结果 表明反义R NA能高效地稳定表达，反义e n v R NA能攣有效地抑制HI V-1的复制，并且反 义p oI R NA使P 2 4抗原减少了1 0 01 00 0禧。另外，国内外在应用反义R N A技术堵育抗病（如 猪瘟、抗鸡马立克氏病等） 动物品系方面也取得比 较明显的进展。反义RNA的抗肿瘤作用肿瘤的发生是多因素引起的，其中细胞癌基因或/ 和某些病壽瘙基因的异常激活和过度表达是导致 细胞恶变的原因之一。如何控制细胞有害基因的 表达而在基因水平上治疗恶性川痢呢？在目前基 因治疗的众多方

8、案屮，反义R NA技术是最具吸引 力的手段之一。可以设计出针对肿瘤细胞的癌基 因、突变皐因I非正常衣达呈闪及某些肿瘤相关 病毒的癌基因反义RNA,以阻断这些有害基因的 表瓊逖到締肿瘤的目的。许多证据裁，反义R N A可使肿瘤细胞的表型逆转，形态变化？增殖速 度减慢，生存期缩短，软琼脂中克隆能力下陳及体内 成瘤能力减弱等，而不影响细胞生存所必需的其它 基因的表达。 Tr o j a n等利用E B病毒游离体表达载体克隆胰 岛素样仆.氐因子(IGF)反义基因，将此重组体 转染大鼠C 6细胞系，在大鼠模型上实现了胶质 母细胞瘤的基因治疗和预防。我国学者赵晓航等报道互补于Grnyc基因第二 -外显了及

9、其两侧序列的反义RNA能特异性诱发 人食管癌细胞程序性死亡。黄贤明等利用G e t s2、G m y c和Nr as三个癌基因联合反义RNA能使人肝癌细胞株S M M C 77 2 1生长速率下降约70 %,软琼脂集 落形成能力及裸鼠致瘤能力显著下降，提示针对多 个癌基因的联合反义R NA可能给肿瘤基因治疗 提供新的途径。反义RNA技术还可用于肠道疾病(Rotba rteta 1，1 988)、心血管疾病、B一地中海贫血、调节衰弱心脏中肌细胞的-Ca2泵体内平衡u、G蛋白防止高血压、- 肝纤维化等多种疾病的研究。參君文献 1张西锋，沈伟,潘庆杰，白丁平，耿社 快.反义RNA技术原理及其在疾病治疗中的应 用J 莱阳农学院学报,2 00 4,2 1 ( 1 )：2 0 ,21,2 22&