实验四 沙门氏菌属(Salmonella)的检验

1、实验四 沙门氏菌属（Salmonella）的检验1 目的 1.1 理解沙门氏菌属生化反应及其原理 1.2 掌握沙门氏菌属血清因子使用方法 1.3 掌握沙门氏菌属的系统检验方法 2 原理 沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。种类繁多，少数只对人致病。其他对动物致病，偶尔可传染给人。主要引起人类伤寒，副伤寒以及食物中毒或败血症。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。 食品中沙门氏菌的检验方法有五个基本步骤：1 前增菌；2 选择性增菌；3 选择性平板分离沙门

2、氏菌；4 生化试验，鉴定到属；5 血清学分型鉴定。目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位。本实验以蛋品为检测样品，以已知的沙门氏菌和大肠埃希氏菌为对照。 3 材料 3.1 菌种 沙门氏菌（Salmonella sp.） 大肠埃希氏菌（E.col.） 3.2 检样 冻肉、蛋品、乳品等。 3.3 培养基 缓冲蛋白胨水（BP）、氯化镁孔雀绿（MM）增菌液、四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、SS琼脂、EMB琼脂、亚硫酸铋琼脂（BS）、三糖铁琼脂（TSI）、蛋白胨水、尿素培

3、养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、鸟氨酸脱羧酶试验培养基、丙二酸钠培养基、氰化钾（KCN）培养基、ONPG培养基、缓冲葡萄糖蛋白胨水、DHL琼脂、HE琼脂。 3.4 试剂 吲哚试剂、V-P试剂、甲基红试剂、氧化酶试剂，沙门菌AF多价诊断血清，革兰氏染色液等。 3.5 器具 天平（称取检样用）、均质器或乳钵、显微镜、广口瓶、三角烧瓶、吸管、平皿、金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架。 4 流程 5 步骤 5.1 前增菌和增菌  沙门氏菌在食品加工过程中，常常受到损伤而处于濒死状态，因此经过加工的食品检验沙门氏菌时应进行前增菌，即用不加任何抑菌剂的

4、培养基缓冲蛋白胨水（BP），进行增菌，使濒死状态的沙门氏菌恢复活力。一般增菌时间为4h，增菌时间不宜过长，由于BP培养基中没有抑菌剂，时间太长了，杂菌也会相应增多。干蛋品特殊，蛋品中的主要病原菌为沙门氏菌，其在加工过程中受到的损伤又较严重，因此应适当延长前增菌时间，一般为1824h。 无菌操作称冻蛋取25g样品，加入盛有225mL灭菌缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内（瓶内预放玻璃珠若干粒），塞紧瓶口，充分摇匀。在36±1培养4h（干蛋品需培养1324h），移10ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液，在42培养1824h。同时另取10ml，加入100ml亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌

5、液内，在36±1培养1824h。 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g（25ml）加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液，取半量，接种于100mLMM（或TTB）增菌液内，于42 oC培养24h；另半量接种于100mLSC增菌液内，于36±1 oC培养1824h。 5.2 分离 取增菌液和混合液各1环，分别划线接种于一个BS平板和一个DHL琼脂平板（或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板）。于36±1 oC培养1824h（DHL、HE、WS、SS）或4048h（BS），观察各个平板上生长的菌落。先

6、观察混合菌种平板，再检查样品平板上有无可疑菌落，挑取菌种平板和样品平板上的可疑菌落进行革兰氏染色与镜检。 5.3 三糖铁高层琼脂初步鉴别 将上述革兰氏阴性杆菌的可疑菌落，挑取数个接种一支三糖铁高层琼脂斜面，于36±1 oC培养1824h，并根据表4-1初步判断是否可疑沙门氏菌。 表4-1肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果 斜面    底层    产气    硫化氢    可能的菌属和种  

7、60;      ±        沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌         ±        沙门氏菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌          

8、;       沙门氏菌属、大肠艾希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属                 伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠艾希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属         ±    &

9、#160;   大肠艾希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌 注：+阳；阴性；多数阳性，少数阴性。 5.4 生化试验 在接种三糖铁琼脂的同时，接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管，于36±1 oC培养1824h，必要时可延长至48h，按表4-2判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其它5种反应结果均可以排除。 表42  肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 反应序号  

10、;  H2S    吲哚    PH7.2尿素    KCN    赖氨酸脱羧酶    判定菌属 A1                       &

11、#160;沙门氏菌属 A2                        沙门氏菌属(少见)爱德华氏菌 A3                     

12、   柠檬酸杆菌 奇异变形杆菌 A4                        普通变形杆菌 B1                      &#

13、160;      沙门氏菌属、埃希氏菌 甲型副伤寒沙门氏菌、埃希氏菌、志贺氏菌属 B2                                      

14、60;                       埃希氏菌    埃希氏菌、志贺氏菌属 B3                    

15、60;  ±                                       克雷伯氏菌族各属 阴沟肠杆菌、柠檬酸杆菌属 B4   

16、60;        ±            摩根氏摩根氏菌、普罗菲登斯菌属 注：三糖铁琼脂底层均产酸；不产酸者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。 KCN和赖氨酸可选用其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。  表示阳性；表示阴性；±表示多数阳性，少数阴性。 5.4.1 反应序号A1  典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有

17、1项异常，按表4-3可判定为沙门氏菌。如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。 表43  沙门氏菌属生化鉴别表 PH7.2尿素    氰化钾（KCN）    赖氨酸    判    定    结    果           

18、60; 甲型副伤寒沙门氏菌 （要求血清学鉴定结果）             沙门氏菌或 （要求符合本群生化特性）             沙门氏菌个别变体 （要求血清学鉴定结果） 注：表示阳性；表示阴性。 5.4.2 反应序号A2      可先作血清学鉴定，如AF多价O血清不凝聚时，补做

19、甘露醇和山梨醇试验，按表4-4判定结果。 表4-4 甘  露  醇    山  梨  醇    判   定   结   果         沙门氏菌靛基质阳性变种 （要求血清学鉴定结果）        

20、; 爱德华氏菌 5.4.3 反应序号B1  三糖高层斜面产酸的菌株可予以排除，不产酸的应该先作血清学鉴定。如AF多价O血清不凝聚时，补做鸟氨酸、ONPG，水杨苷、棉子糖和半动力试验。按表4-5 判断结果。必要时按表4-6进行沙门氏菌生化群的鉴别 表45  沙门氏菌属各生化群的鉴别 赖氨酸    鸟氨酸    ONPG    水杨苷    棉子糖   

21、; 动力    判定结果                         沙门氏菌                    

22、;     志贺氏菌属                         宋内氏志贺氏菌属 d    d    d    d    d 

23、60;  d    埃希氏菌属 注：表示阳性；表示阴性。 表46  沙门氏菌属各生化群的鉴别 项    目                         卫 矛 醇    

24、60;                    山 梨 醇                         水 杨 苷 &

25、#160;                       ONPG                         丙二酸盐 

26、60;                       KCN                         注：表示阳性；表示阴性。 5.5

27、 血清学分型鉴定 5.5.1  抗原的准备 一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如 2.5%3%）培养基上检查，O抗原在干燥环境中发育较好；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%0.8%半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.30.4%半固体琼脂的小玻管12次，自远端取菌培养后再检查。 5.5.2  O抗原的鉴定 用AF

28、多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。 被AF多价O血清凝集者，一次用O4、O3.10、O7、O8、O9、O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3.10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。 不被AF多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。

29、每种多价O血清所包括的O因子如下： O多价1  A，B，C，D，E，F群（并包括6，14群） O多价2  13，16，17，18，21群 O多价3  28，30，35，38，39群 O多价4  40，41，42，43群 O多价5  44，45，47，48群 O多价6  50，51，52，53群 O多价7  55，56，57，58群 O多价8  59，60，61，62群 O多价9  63，65，66，67群 5.5.3

30、  H抗原的鉴定 属于AF各O群的常见菌型，依次用表7所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。 表4-7   AF群常见菌型H抗原表 O群    第1相    第2相 A    a    无 B    g，f，s    无 B    i，b，d    2 C1    k，v，r，c    5，Z15 C2    b，d，r    2，5 D（不产气的）    d    无 D（产气的）    g，m，