中草药对仔猪免疫功能的影响研究

1、复方中草药“猪康散”对仔猪细胞免疫功能、抗氧化及生产性能影响的研究摘要：为了研究在断奶仔猪的日粮中添加复方中药“猪康散”对其细胞免疫功能的影响。选取生长健康、体壮20日龄杜长大三元杂交仔猪35头，随机分成5个组并在20日龄时进行体内抗体水平的检测，据体内抗体水平将其编号，随机分成5组。其中，第1组为对照组，第2、3、4、5组为试验组。在第26-30日龄时将“猪康散”按0.5%、1.0%、2%三个浓度梯度混于饲料中饲喂2、3、4组仔猪，其余时间饲喂基础日粮。并且所有试验猪均在第21日龄时以2头份/头的剂量用猪瘟兔化弱毒苗进行免疫，第5组为转移因子组，注苗时应将转移因子与疫苗一同混合后再注射，其他

2、均相同。所有试验猪均于第35、45、55、65日龄时无菌前腔静脉采血；结果表明： 1%中药组的平均日增重、平均日采食量、淋巴细胞转化率、细胞亚群、SOD、GSH-Px均显著或不显著的高于对照组转移因子组、0.5%中药组、2%中药组(P<0.05或P>0.05)，1%中药组料肉比显著低于对照组(P<0.05)；血清中MDA有下降的趋势，但差异不显著（P>0.05）。由此说明，在仔猪日粮中添加1%的复方中药“猪康散”能增强仔猪细胞免疫功能，提高仔猪生产性能和抗氧化能力。关键词：中草药“猪康散”；仔猪；生产性能；免疫功能近年来，随着规模化养猪业的发展，不合理的用药、不规范的生

3、产养殖以及不科学的饲养管理等，使得猪病越演越严重，尤其是免疫抑制性疾病更为突出，每年都给养殖业造成了巨大的损失。为了提高经济效益，现在人们开始将目光投向了毒性低与无抗药性、经济实用等优点的中草药，并且逐渐将它广泛应用于养猪业。本实验所用的复方中草药“猪康散”是按“扶正祛邪”、“正气存内，邪不可干”的中医理论科学组方而成的纯中药制剂。复方中草药“猪康散”是由金银花、连翘、板兰根、大青叶、黄连、黄芩、黄柏、忍冬藤、栀子、石膏、知母等17位中药组成，方中单味中药金银花、板兰根、大青叶、黄连、黄芩等均具有直接或间接的免疫增强作用。1实验材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物 选取体壮健康，胎次、日

4、龄相同的平均体重在5Kg左右的，20日龄杜长大三元杂交仔猪35头，根据体重相近，公母各半的原则随机分成5个组，每组7头，即对照组、转移因子组、0.5%中药组、1%中药组、2%中药组。饲养实验时间45天。1.1.2 实验器材试剂 流式细胞仪、恒温水浴锅、CO2培养箱、超净工作台、冷冻离心机、显微镜、淋巴细胞分离液（1.077）、1640培养液、小牛血清、双抗、台盼蓝、二甲基亚砜、转移因子、猪瘟弱毒疫苗1.1.3中药 复方中草药“猪康散”是由金银花、连翘、板兰根、大青叶、黄连、黄芩、黄柏、忍冬藤、栀子、石膏、知母等17位中药组成。按比例配方粉碎过60目筛，塑料袋500 g/袋分装备用。1.2实验设

5、计 第1组为对照组，第2、3、4、5组为试验组。在第26-30日龄将复方中药“猪康散”按0.5%、1.0%、2.0%三个浓度梯度混于饲料中饲喂2、3、4组仔猪，其余时间饲喂基础日粮；5是转移因子组，只是在注猪瘟疫苗时应将转移因子与苗一同混合后再注射，而不用“猪康散”，并且所有试验猪均在第21日龄时以2头份/头的剂量用猪瘟兔化弱毒苗进行免疫，其他饲养管理均相同。实验基础日粮参照 NRC (1998年 )猪营养标准配制，其配方及营养水平见表 1。表1 基础日粮配方和营养水平日粮组成含量(%)营养水平含量(%)玉米 58.27消化能DE(MJ/Kg )13.80豆粕24.5粗蛋白20.2(20.20

6、)鱼粉7. 00 钙0.86(0.88)乳清粉 6. 00 总磷0.63(0.64)大豆油1. 30 有效磷042盐酸赖氨酸 0. 24赖氨酸1.30石粉 0. 80 蛋氨酸0.36磷酸氢钙0. 64 食盐 0.25 复合预混料 1.00 注:中药组除在饲料中按0.5%、1%、2%添加中药外，其他均同基础饲粮。每1 kg基础饲粮含维生素A 5.4×107IU、维生素D31.08×108IU、维生素E 1.8×104IU、维生素 K35g、维生素B1 2g、 维生素B215g、维生素B6 6g、维生素B12 30 mg、烟酸35g、泛酸钙13mg、叶酸 850 mg

7、、Fe 155 mg、Cu 10 mg、Mn 100mg、Zn 100 mg、Se 0.25mg、 0.35mg、Co 0.2mg。1.3指标的测定及方法 所有试验仔猪在35、45、55、65日龄时3次前腔静脉采血4ml，血样分为 2 份，2 ml一份用肝素抗凝，另一份为非抗凝血。肝素抗凝血用于细胞亚群及淋巴细胞转化率的测定。非抗凝血4000 r/min离心15 min，将血清分装于EP管中，然后封口，置于- 20低温冰箱中保存用于抗氧化指标的测定。1.3.1生产性能 采食量：实验期间以圈为单位准确测定和记录每10天饲料喂量，并计算每10天及全期(35-65日龄)各阶段的平均日采食量(ADFI

8、)。日增重：在试验期间的第35日龄、第45日龄、第55日龄、第65日龄清晨700 称量仔猪空腹体重。并计算各阶段(每10天及全期) 的平均日增重(ADG)。料重比：根据各阶段的平均日采食量与平均日增重之比来计算各个阶段的料重比(F/ G)。1.3.2淋巴细胞转化率 用真空抗凝采血管无菌前腔静脉采血1mL，置于10mL离心管中，用Ca2 +、Mg2 +的 Hank，s液等倍稀释后，然后沿管壁缓缓叠加到盛有1mL淋巴细胞分层液的10ml离心管上层，25，2 000r/min离心20min；用巴氏吸管吸取中间云雾状白细胞部分，再用3-5倍体积无 Ca2 +、Mg2 +的Hank，s液洗 3次，每次4

9、，1500 r /min离心10min；最后将细胞悬浮于RPMI 1640完全培养液中，并用台盼蓝染色并计数活细胞数( > 95% )，调整细胞浓度为2×106个/mL；将淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板中，ConA使终浓度为 5g/mL，另一组加入等体积的1640培养液作为对照，培养体系为每孔100L；置37、5%CO2培养箱内培养48 h；在培养结束前4小时，每孔加入初始浓度为 5 mg/mL的四甲基偶氮唑盐(MTT)10L，继续培养；培养结束后，每孔加入100L二甲基亚砜，并摇动，使紫色结晶完全溶解；用酶联免疫检测仪在570nm波长处测光密度(OD)值。根据测定结果按下列

10、公式计算外周血淋巴细胞转化率。转化率=ConA刺激孔的OD值无ConA刺激孔OD值/无ConA刺激孔的OD值。1.3.3细胞亚群 用购自美国Southern Biotechnology Associates，Inc 公司的抗猪淋巴细胞 CD3 (8E6，LgG1 )单克隆抗体，FTTC标记；抗猪淋巴细胞CD4 (7421224，LgG2b)单克隆抗体，为FTTC标记；抗猪淋巴细胞CD8(7622211，LgG2a) 单克隆抗体，为Biotin标记，采用美国Coulter公司 EPICS2 XL流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+）的数量测定。1.3.4抗氧化酶 用南

11、京建成生物工程研究所生产的 SOD、GSH-Px和MDA 检测试剂盒进行测定。按试剂盒说明书要求操作，采用日本岛津公司生产的UV-2501PC紫外可见分光光度计测定各测定管的OD值，最后计算出样品中SOD、GSH-Px和MDA的值。超氧化物歧化酶测定试剂盒，羟胺法，批号为20101027；谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒，比色法，批号为20101103；丙二醛测定试剂盒，TBA法，批号为20101104；一氧化氮测定试剂盒，硝酸还原酶法，批号为20101027；。一氧化氮合酶测定盒，20101014。以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。1.4 数据处理与分析 所有数据用 SPSS16.0统计软

12、件进行单因素方差分析和LDS多重比较。试验数据以平均数±标准差表示。2结果与分析2.1复方中药“猪康散”对仔猪生产性能的影响 由表2可看出：平均日采食量：在35-45日龄时1%中药组显著高于各实验组（P<0.05），转移因子和0.5%中药组显著高于对照组和2%中药组（P<0.05），46-55日龄时2%中药组极显著高于对照组（P<0.01），0.5%中药组显著高于2%中药组和对照组，46-55日龄时，1%中药组极显著高于各实验组（P<0.01），转移因子组、0.5%中药组显著高于对照组和2%中药组 (P<0.05)；平均日增重：35-45日龄时，各实验组

13、之间均差异不显著（P>0.05），46-55日龄1%中药组极显著高于对照组（P<0.01），显著高于各实验组（P<0.05），56-65日龄时，1%中药组极显著高于对照组（P<0.01），转移因子组显著高于对照组、2%中药组，所有实验组在日增重上均高于对照组；料肉比：35-45日龄段各实验组之间料肉比差异不显著（P>0.05），但均低于对照组，46-55日龄段中1%中药组的料肉比显著低于对照组、0.5%中药组、2%中药组(P<0.05)，跟转移因子组之间差异不显著，所有实验组均低于对照组，56-65日龄时，除0.5%中药组跟对照组不显著外，其他各实验组之间均

14、显著低于对照组（P<0.05）；在整个实验期间，以1%中药组中仔猪增重最为明显，料肉比最低。 表2试验期中草药“猪康散”对仔猪生产性能的影响日 龄分 组平均日采食量ADFI(g)平均日增重ADG (g)料 肉 比(F/G)35-45日龄对照组258.12±0.02a206.60±0.10a1.26±0.05a转移因子组277.66±0.02b217.20±0.14a1.18±0.14a0.5%中药组276.92±0.01b217.00±0.27a 1.26±0.13a1%中药组293.42±

15、;0.03c275.00±0.40a1.17±0.5a2%中药组259.36±0.02a 224.40±0.20a 1.27±0.10a 46-55日龄对照组565.80±0.05Ba363.60±0.29Aa1.59±0.11b转移因子组599.80±0.04ABab423.60±0.41ABa1.47±0.14ab0.5%中药组622.60±0.25Ab440.20±0.70ABa1.54±0.21b1%中药组620.20±0.01ABab5

16、77.60±0.33Bb1.09±0.07a2%中药组588.40±0.01Ab399.40±0.30ABa1.51±0.11b56-65日龄对照组722.70±0.02Aa526.40±0.74Aa1.51±0.25b转移因子组748.40±0.05Cb684.20±0.16ABbc1.10±0.03a0.5%中药组739.20±0.04BCb635.80±0.19ABab1.17±0.04ab1%中药组777.52±0.01Dc774.20&

17、#177;0.41Bc1.02±0.05a2%中药组728.50±0.01ABa 531.80±0.39Aa1.40±0.11ab注：同列右标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05 )，大写字母相同表示差异不显著(P>0.05 ) ，不同小字母表示差异显著(P< 0.05) ，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01 )，下表同。2.2复方中药“猪康散”对仔猪淋巴细胞转化率的影响表由表3可知：对照组、转移因子组、0.5%中药组、1%中药组、2%中药组这五个实验组之间均无统计学意义上的差异显著（P>0.05）。在35日龄、4

18、5日龄、55日龄三个日龄段，1%中药组转化率均高于对照组、转移因子组、0.5%中药组和2%中药组，转移因子组、0.5%中药组、2%中药组均高于对照组。 表3复方中药“猪康散”对仔猪淋巴细胞转化率的影响 日 龄分 组35日龄45日龄55日龄对照组0.38±0.03a0.50±0.07a0.53±0.07a转移因子组0.43±0.12a0.61±0.05a0.63±0.08a 0.5%中药组0.42±0.12a0.54±0.06a0.62±0.03a 1%中药组0.47±0.09a0.66±

19、;0.06a0.67±0.09a 2%中药组0.43±0.04a0.58±0.02a0.59±0.10a 2.3复方中药“猪康散”对仔猪T细胞亚群的影响由表4可知：35日龄和45日龄段时1%中药组的CD3%值均高于各实验组，显著高于转移因子组（P<0.05），但跟对照组、0.5%中药组、2%中药组差异不显著（P>0.05）；55日龄时，CD3值显著高于对照组（P<0.05），跟0.5%中药组、2%中药组、转移因子组差异不显著（P>0.05）；35日龄时，1%中药组CD3CD4%值显著高于对照组和0.5%中药组（P<0.05）

20、，跟2%中药组和转移因子组差异不显著（P>0.05）；45日龄时，CD3CD4%显著高于对照组、转移因子组、0.5%中药组、2%中药组（P<0.05），转移因子组、0.5%中药组、2%中药组也显著高于对照组（P<0.05）；转移因子组、0.5%中药组、2%中药组之间差异不显著（P>0.05）；55日龄时，CD3CD4%显著高于对照组、0.5%中药组、2%中药组（P<0.05）；CD3CD8%：35日龄时，1%中药组CD3CD8%显著高于0.5%中药组（P<0.05），45日龄时，各实验组之间差异不显著（P>0.05），55日龄时，1%中药组显著高于对照

21、组（P<0.05）；CD4/CD8：35日龄时，1%中药组CD4/CD8显著高于对照组和2%中药组（P<0.05），转移因子组差异显著高于2%中药组（P<0.05），45日龄和55日龄各实验组之间差异不显著（P>0.05），但1%中药组与转移因子组值较为相近且均高于对照组、0.5%中药组、2%中药组。表4复方中药“猪康散”对仔猪T淋巴细胞亚群的影响日龄分 组CD3（%）CD3CD4（%）CD3CD8（%）CD4/CD835日龄对照组65.33±0.38ab33.98±0.76a23.34±0.60ab1.28±0.05ab转移因子

22、组62.05±2.40a36.09±1.33ab26.69±1.22ab 1.60±0.09bc0.5%中药组66.84±1.26ab34.17±2.31a20.38±1.62a1.54±0.11abc1.0%中药组70.14±1.20b39.57±0.53b29.57±3.14b1.70±0.12c2.0%中药组65.94±3.79ab35.55±0.82ab26.11±2.3ab1.24±0.14a45日龄对照组56.78±

23、;3.34a26.74±0.84a30.68±4.40a0.91±0.15a转移因子组63.1±0.47ab 31.02±0.95b35.76±6.20a1.00±0.06a0.5%中药组63.72±0.53ab30.44±0.34b31.08±1.37a 0.90±1.38a1.0%中药组66.18±3.79b36.68±0.86c37.13±3.64a1.16±0.12a2.0%中药组62.91±1.02ab30.43±0

24、.45b30.85±2.90a0.80±0.10a55日龄对照组52.41±3.30a24.64±3.70a33.43±5.50a0.66±0.01a 转移因子组62.45±0.13b29.31±0.17ab44.53±0.58b0.73±0.28a0.5%中药组59.10±4.36ab25.38±1.50a45.80±0.65 b0.54±0.04a1.0%中药组63.75±1.33b34.39±1.05b47.19±3.7

25、0b 0.75±0.03a2.0%中药组59.63±0.64ab28.18±0.77a45.49±6.49b0.62±0.07a2.4复方中药“猪康散”对仔猪抗氧化的影响由表5可知：55日龄时，1%中药组的SOD值显著高于对照组(P<0.05)，而跟转移因子组、0.5%中药组和2%中药组差异不显著(P>0.05)；65日龄时，1%中药组的SOD值显著高于对照组、转移因子组、0.5%中药组和2%中药组，转移因子组也显著高于、0.5%中药组和2%中药组；35日龄和45日龄，差异不显著（P>0.05），但各实验组均高于对照组。GSH

26、-Px在45日龄时，1%中药组显著高于对照组(P<0.05)，而在35日龄和55日龄时，转移因子组、0.5%中药组和2%中药组，在统计学意义上，差异不显著，但各实验组仍高于对照组，65日龄时，1%中药组和转移因子组显著高于对照组(P<0.05)。MDA：除45日龄时，各实验组显著低于对照组(P<0.05)外，其余各实验组在统计学意义上差异不显著（P>0.05），但1%中药组在整个实验期均低于对照组、转移因子组、0.5%中药组和2%中药组，35日龄时，转移因子低于对照组、0.5%中药组和2%中药组。在从整个实验来看，SOD、GSH-Px随着日龄增长而逐渐增加，MDA显著或

27、不显著的逐渐降低，且以1%中药组效果最为显著。表5 复方中药“猪康散”对仔猪抗氧化酶SOD、GSH-Px、MDA的影响指标分组35日龄45日龄55日龄65日龄SOD对照组116.84±3.75a129.43±2.35a133.42±3.78b133.78±5.51a转移因子134.67±11.20a135.92±3.40a142.98±3.95ab152.91±1.77b0.5%中药组127.99±2.64a135.04±9.29a138.44±0.87ab141.02±4.

28、30ab1.0%中药组135.31±4.66a145.40±7.23a152.07±6.19a170.07±4.46c2.0%中药组129.43±7.01a133.41±5.68a135.94±4.99ab140.64±4.72abGSH-Px对照组410.30±1.85a442.05±24.49a477.58±46.68a527.88±21.00a转移因子440.01±55.18a546.06±51.31ab638.18±9.09a705.15

29、±15.41b0.5%中药组418.28±17.09a509.70±60.82ab539.77±1.20a600.91±28.18ab1.0%中药组495.48±36.62a664.85±65.69b692.57±70.79a762.70±17.09b2.0%中药组421.82±25.80a581.82±72.52ab577.28±55.86a612.73±96.25abMDA对照组4.05±0.67a3.82±0.13a3.58±0.

30、64a2.91±0.68a转移因子3.11±0.11a2.71±0.37b2.50±0.35a2.17±0.06a0.5%中药组3.51±0.87a2.92±0.17b2.72±0.61a2.39±0.09a1.0%中药组2.99±0.45a2.61±0.17b2.31±0.31a2.06±0.27a2.0%中药组3.27±0.26a2.78±1.48b2.52±0.13a2.21±0.18a3讨论3.1复方中药“猪康散”对仔

31、猪生产性能的影响目前大量研究报道表明：中草药具有药用和营养的双重效用，应用中草药饲料添加剂能改善仔猪消化道功能、增强消化酶活性，从而增强机体对养分的消化吸收和合成代谢，促进生长发育，增强机体免疫机能，维护机体的健康，从而实现加快动物生长速度和提高饲料报酬1-3。陈燕凌等4试验表明，在日粮中添加复方中草药制剂能增加断奶仔猪的体重、日增重、日采食量等，降低料重比，在一定程度上改善生产性能。尹富贵等试验表明5 ，在日粮中添加0.2中草药复方添加剂可缓解断奶仔猪断奶应激，并可显著提高断奶仔猪的平均日增重，降低料肉比。李和平6在肉鸡日粮中添加1%“禽康散”能明显的提高肉鸡平均日增重和降低料肉比，提高饲料

32、转化率，实现对肉鸡生产性能的提高。本实验结果表明：在日粮中添加不同浓度的中药和转移因子，能不同程度的提高仔猪的平均日采食量和平均日增重，效果不显著，而1%中药添加组能显著提高仔猪平均日增重和降低料肉比（P<0.05），这可能跟复方中药“猪康散”组成有关。方中的大青叶、板蓝根、黄连等就决定了它具有清热解毒，抗菌消炎的作用，能够有效的改善仔猪胃肠道内微生物环境，减少腹泻，而增强仔猪抵抗力，有利于营养物在肠道能够充分吸收；同时中草药含有多种营养元素和有效活性成分能提高胃肠道内各种消化酶的活性，增强新陈代谢，加快血液循环，来提高仔猪生产性能。3.2复方中药“猪康散”对淋巴细胞转化率的影响淋巴细胞

33、增殖试验是检测机体细胞免疫功能的一种体外试验，淋巴细胞的转化程度可反映机体细胞免疫功能的水平，因此可作为检测细胞免疫功能的重要指标之一。T淋巴细胞转化率越高，意味着淋巴细胞在外来因子的刺激下增殖反应上升，机体的细胞免疫能力提高主要分为非特异性刺激和特异性刺激两种。理论上讲，非特异性刺激(如ConA，PHA等)可以使60-70左右的淋巴细胞发生增殖，而特异性抗原刺激可以使5-30的细胞发生转化7。本实验在35日龄、45日龄、55日龄三个日龄段时对照组、转移因子组、0.5%中药组、1%中药组、2%中药组的淋巴细胞转化率差异均不显著（P>0.05），在实验期间1%中药组仔猪淋巴细胞转化率均高于

34、转移因子组、0.5%中药组、2%中药组、对照组，转移因子组又都高于0.5%中药组、2%中药组、对照组。从整个实验期可以看出：在55日龄时，淋巴细胞转化率最高，由此也就说明，随着日龄的增长仔猪的免疫功能不断完善。3.3复方中药“猪康散”对仔猪淋巴细胞亚群的影响T细胞是体内重要的细胞免疫应答细胞，CD3是成熟T细胞的表面标志，T淋巴细胞根据其表面标记抗原主要分为CD4+和CD8+两大细胞亚群，CD4+CD8+是免疫应答所不可缺少的亚群，是评估机体免疫状态的重要依据，是机体免疫内环境稳定最重要的指标。在与其它动物相比，猪具有非常特殊的淋巴解剖学结构和不寻常的林巴细胞迁移行为，包括高比例的CD4+CD

35、8+细胞亚群和低比值的CD4/CD8细胞比8。Annin Saalmu11er等9研究中发现在幼龄阶段猪的CD4-CD8-细胞比例较高，而成年时CD4+CD8+细胞已具有较高水平，约占T淋巴细胞的21%，这表明抗原依赖性CD8+表达逐渐增多，这种变化已被体外刺激实验中CD4+CD8+的产生所证明。本实验中随着日龄的增加CD3%细胞在逐渐增加，表明T细胞总数增加；CD3CD4% T细胞的显著增高，意味着活化T细胞数在增加，机体的免疫调节功能处于亢进状态；CD4/CD8值逐渐降低可能跟CD8+表达增多有关；同时，用转移因子组、0.5%中药组和2%中药组CD3CD8%逐渐增多可能就与用药后使免疫细胞

36、受抗原刺激而导致抗原依赖性CD8+过度增多有关。3.4复方中药“猪康散”对仔猪抗氧化酶的影响近年来，发现一些天然中草药具有提高抗氧化酶的活性，能够清除自由基的危害，提高动物体自身的免疫能力10。目前已有研究证实了许多中药具有较强的抗氧化作用，如淫羊霍、甘草、首乌、山楂、当归等11。SOD就是生物体内清除自由基的抗氧化酶的一种。SOD广泛存在于生物体的各种组织中，可使超氧阴离子歧化为H2O2而被清除。血清中SOD活力高低间接反映了机清除自由基的能力。而GSH-Px也是以一定的方式清除自由氧和脂质过氧化物，从而保护细胞膜结构和功能的完整性。MDA可以反映机体脂质过氧化产物生成速率和强度，也间接反映组织LPO损伤程度12-13。本方所用的黄芩的活性成分总黄酮以及黄连活性成份小蘖碱都具有良好的清除氧自由基的作用，而多糖也有部分清除氧自由基的作用14。张杲15研究认为，连翘提取物及连翘果实提取物中的连翘苷、连翘酯苷都有具有很强的抗氧化能力，这可能与中断脂质过氧化链式反应，或清除自由基保护抗氧化酶免受自由基损伤，来提高抗氧化酶的活性。本实验结果表明： 0.5%中药组、1%中药组、2%中药组中SOD酶、GSH-Px酶均显著或不显著的高于对照组（P<0.05