BioRad定量PCR说明书学习课程

1、Outline Real Time PCR and Conventional PCR Introduction to Quantitative PCR Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory Laboratory Technique Primer Design for Real-Time PCR第1页/共76页第一页，编辑于星期五：十二点 一分。Real Time PCR and Conventional PCR第2页/共76页第二页，编辑于星期五：十二点 一分。技术背景 本来，本来，PCRPCR技术是为了将样本中微量的技术是为了将样本中微

2、量的DNADNA模版放大以模版放大以便研究模版特性便研究模版特性 随着研究的深入，需要了解样本中基因的表达模式与疾随着研究的深入，需要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，这就要了解标本中的病的关系，这就要了解标本中的DNADNA原始拷贝数。原始拷贝数。第3页/共76页第三页，编辑于星期五：十二点 一分。DenaturationPrimer AnnealingElongation53535353535355TaqTaqRepeat常规常规 PCRProcessIn theory, product accumulation is proportional to 2n, where n is th

3、e number of amplification cycle repeats第4页/共76页第四页，编辑于星期五：十二点 一分。nA linear increase follows exponentialnEventually plateausCycle #TheoreticalReal LifeLog Target DNAReality vs. TheoryAmplification is exponential, but the exponential increase is limited:第5页/共76页第五页，编辑于星期五：十二点 一分。常规常规PCR方法的局限性分析：方法的局限性

4、分析：无法对起始模板准确定量无法对起始模板准确定量, ,只能对终产物进行分只能对终产物进行分析析对终产物分析，受对终产物分析，受PCRPCR过程平台效应的干扰，过程平台效应的干扰，定量准确度难以提高（相对误差定量准确度难以提高（相对误差1000%1000%）；）；存在扩增产物的污染问题。存在扩增产物的污染问题。必须在扩增后用电泳方法分析必须在扩增后用电泳方法分析, ,费时费力而且费时费力而且EBEB有毒有毒无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测第6页/共76页第六页，编辑于星期五：十二点 一分。 C(t)s from 96 replicates are nearly identical,

5、 but the final fluorescence varies.CycleEnd PointPCR: Theory vs. Reality第7页/共76页第七页，编辑于星期五：十二点 一分。 实时定量实时定量PCR技术，是指在技术，是指在PCR反应体系中加反应体系中加入入荧光基团荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得进程，使每一个循环变得“可见可见”，最后通过，最后通过Ct值值和标准曲线和标准曲线对样品中的未知样品对样品中的未知样品 的起始浓度进行定的起始浓度进行定量的方法。量的方法。 Real-Time PCR第8页/共76页第

6、八页，编辑于星期五：十二点 一分。 Quantitative PCR 或或 Real time PCR 是确定样品中是确定样品中DNA (或或 cDNA) 拷贝拷贝数最敏感、最准确的方法数最敏感、最准确的方法Quantitative PCR /Real time PCR第9页/共76页第九页，编辑于星期五：十二点 一分。 C(t)s from 96 replicates are nearly identical, but the final fluorescence varies.CycleEnd PointC(t)PCR: Theory vs Reality第10页/共76页第十页，编辑于星

7、期五：十二点 一分。Quantitative information comes from monitoring the early stages of amplification.第11页/共76页第十一页，编辑于星期五：十二点 一分。常用的定量方法常用的定量方法 相对定量：相对于另一参照样本的量；相对定量：相对于另一参照样本的量； 绝对定量：用标准品作标准曲线来推算未知的样本的量。绝对定量：用标准品作标准曲线来推算未知的样本的量。第12页/共76页第十二页，编辑于星期五：十二点 一分。Quantitative PCR和常规和常规PCR技术的区技术的区别别 常规常规PCR是通过电泳对扩增反应

8、的最终产物进行定性分析（是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不定量不准确准确）；）； Quantitative PCR是在是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得进程，使每一个循环变得“可见可见”，通过通过Ct值和标准曲线对样品中的值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行的起始浓度进行定量的方法（定量的方法（准确定量准确定量） 。第13页/共76页第十三页，编辑于星期五：十二点 一分。Introduction to Quantitative PCRPCR仪仪

9、 + 监测、分析系统监测、分析系统 + 荧光标记荧光标记 第14页/共76页第十四页，编辑于星期五：十二点 一分。第15页/共76页第十五页，编辑于星期五：十二点 一分。温度梯度温度梯度选择可以选择可以允许使用者在同一允许使用者在同一次扩增中优化复性次扩增中优化复性温度。温度。采用多点温控和传采用多点温控和传感技术，可以实现感技术，可以实现梯度梯度PCR功能功能第16页/共76页第十六页，编辑于星期五：十二点 一分。采用采用0.2ml的离心管的离心管, 排管和排管和 96孔孔PCR反应板。反应板。 降低消耗品成本。降低消耗品成本。同时扩增和检测同时扩增和检测96个样品个样品第17页/共76页第

10、十七页，编辑于星期五：十二点 一分。Introduction to Quantitative PCRPCR仪仪 + 监测、分析系统监测、分析系统 + 荧光标记荧光标记 第18页/共76页第十八页，编辑于星期五：十二点 一分。第19页/共76页第十九页，编辑于星期五：十二点 一分。DetectorEmissionFilterLight SourceExcitationFilter第20页/共76页第二十页，编辑于星期五：十二点 一分。53FQTubulin53HQGapdH53TXQb b-actin53Cy5QCyclophilinMultiplexing-第21页/共76页第二十一页，编辑于

11、星期五：十二点 一分。CycleLog Relative FluorescenceTexas RedFAMHexCy51010010001471013161922252831343740434649TubulinCyclophilinbeta ActinGAPDHMultiplexing第22页/共76页第二十二页，编辑于星期五：十二点 一分。v可兼容的定量方法：可兼容的定量方法： SYBR Green I、Taqman探针、探针、Beacon探针、探针、FRET探针探针v可兼容的突变检测方法：可兼容的突变检测方法： 熔点曲线功能、熔点曲线功能、MGB探针探针v可兼容的试剂种类：可兼容的试剂种

12、类： 所有国产与进口试剂所有国产与进口试剂第23页/共76页第二十三页，编辑于星期五：十二点 一分。 iQ5 Data Analysis Software iQ5 Data Analysis Software 第24页/共76页第二十四页，编辑于星期五：十二点 一分。第25页/共76页第二十五页，编辑于星期五：十二点 一分。第26页/共76页第二十六页，编辑于星期五：十二点 一分。标准曲线标准曲线定量计算定量计算第27页/共76页第二十七页，编辑于星期五：十二点 一分。第28页/共76页第二十八页，编辑于星期五：十二点 一分。基因表达分析第29页/共76页第二十九页，编辑于星期五：十二点 一分

13、。Introduction to Quantitative PCRPCR仪仪 + 监测、分析系统监测、分析系统 + 荧光标记荧光标记 第30页/共76页第三十页，编辑于星期五：十二点 一分。l ll ll ll lDetection Chemistries第31页/共76页第三十一页，编辑于星期五：十二点 一分。Non-specific DNA binding dyesSYBR Green ISYBR GoldEthidium Bromide Specific Hybridization ProbesCleavage Probes (TaqManTM)Molecular beaconsScor

14、pionsTMAmplifluorTMLUXTMdual-oligo FRET pairsQuantitative PCR Detection Chemistries第32页/共76页第三十二页，编辑于星期五：十二点 一分。DNA Binding Dyes35BDBD5BDBDBD第33页/共76页第三十三页，编辑于星期五：十二点 一分。Extension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatDNA binding dyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlll

15、ll第34页/共76页第三十四页，编辑于星期五：十二点 一分。DNA Binding Dyes Advantages!Inexpensive compared to hybridization probesNo additional design work than the primer used for PCR reaction However Not template specific, will bind ALL double stranded DNA inducing primer-dimer and unspecific amplicon formationMultiplex ass

16、ays not possible第35页/共76页第三十五页，编辑于星期五：十二点 一分。Typical “first step” experiment: Evaluate Primer SpecificityUsing Melt Curve Analysis Evaluate Primer Pair EfficienciesBy running serial dilutions of template as standards Identify Sub-Optimal aspects of assayOptimize further with thermal gradient, etc.第3

17、6页/共76页第三十六页，编辑于星期五：十二点 一分。Cleavage Probes (TaqManTM)53QFTaq5q3l l3535FQ第37页/共76页第三十七页，编辑于星期五：十二点 一分。第38页/共76页第三十八页，编辑于星期五：十二点 一分。Cleavage-based assay:TaqManTM5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQ

18、Probe53RQ第39页/共76页第三十九页，编辑于星期五：十二点 一分。535353RQExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Detection533QTaqR5lRCleavage-based assay:TaqManTM第40页/共76页第四十页，编辑于星期五：十二点 一分。Cleavage Probes (TaqManTM)Advantages! Generates a robust cumulative fluores

19、cence signal Simple to design and synthesize compared to other hybridization probes (i.e. beacons) Ideal approach for multiplex assays SNP (Single Nucleotide Polymorphism) assay possibleHowever More expensive than DNA binding dyes第41页/共76页第四十一页，编辑于星期五：十二点 一分。Molecular BeaconsRQMolecularBeacon535353R

20、Q第42页/共76页第四十二页，编辑于星期五：十二点 一分。第43页/共76页第四十三页，编辑于星期五：十二点 一分。第44页/共76页第四十四页，编辑于星期五：十二点 一分。Molecular BeaconsAdvantages! Good for SNP (Single Nucleotide Polymorphism) detection Multiplex assays possibleHoweverMolecular Beacons Are DIFFICULT to Design and Synthesize Does NOT generate a cumulative fluores

21、cence signal, much weaker signal than the 5 Nuclease Assay (Cleavage probe)Expensive!第45页/共76页第四十五页，编辑于星期五：十二点 一分。Hybridization oligos should have Tms 6 12 degrees higher than the associated primers.Avoid secondary structure in the complementary region of the probe.Avoid Gs at the 5 end of the probe

22、 sequence.Use oligo analysis tools to check probe for:DimerizationSecondary StructureCross Reactivity with Primers第46页/共76页第四十六页，编辑于星期五：十二点 一分。 Each method has advantages and disadvantages Bio-Rad Real-Time Instrumentation is equipped to handle all chemistries One method may be more appropriate for

23、an application over anotherWhich Method to Use?第47页/共76页第四十七页，编辑于星期五：十二点 一分。Outline Real Time PCR and Conventional PCR Introduction to Quantitative PCR Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory Laboratory Technique Primer Design for Real-Time PCR第48页/共76页第四十八页，编辑于星期五：十二点 一分。Ct value and Real-Ti

24、me Quantitative PCR Theory第49页/共76页第四十九页，编辑于星期五：十二点 一分。基线（基线（baseline) baseline) 阈值阈值(threshold)(threshold) 基线（基线（baselinebaseline）的设置以）的设置以PCRPCR反应的前反应的前1515个循环的荧光信号作为荧光本底信号个循环的荧光信号作为荧光本底信号 阈值阈值(threshold)(threshold)的设置一般是的设置一般是3-153-15个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的1010倍。倍。 PCRPCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值

25、。扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。第50页/共76页第五十页，编辑于星期五：十二点 一分。阈值循环数阈值循环数CtCt PCRPCR扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段所对应的循环次数，也就是荧光信号达长阶段所对应的循环次数，也就是荧光信号达到阈值时的循环次数。到阈值时的循环次数。第51页/共76页第五十一页，编辑于星期五：十二点 一分。 从图中的重复实验中可以直观地看到，随着从图中的重复实验中可以直观地看到，随着PCRPCR反应反应过程，荧光信号从基线经一个转折点进入指数期、线性过程，荧光信号从基线经一个转折点进入指数期、线性期和最终的

26、平台期，尽管平台期期和最终的平台期，尽管平台期DNADNA拷贝数波动很大，拷贝数波动很大，CTCT值却是相对固定的。值却是相对固定的。CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系Cycle第52页/共76页第五十二页，编辑于星期五：十二点 一分。 如果用不同浓度模版如果用不同浓度模版DNADNA作作PCRPCR，可以看出模版，可以看出模版浓度越高，浓度越高，CTCT值越小。值越小。第53页/共76页第五十三页，编辑于星期五：十二点 一分。 模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1

27、个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达第54页/共76页第五十四页，编辑于星期五：十二点 一分。 1 CT Difference = 2 fold difference in starting template amount 3.3 CT Difference = 10 fold difference in starting template amountProductT=(Template0)2nWhere n=Number of CyclesMathematic ImplicationsIdeal PCR第55页/共76页第五十五页，编辑于星期五：十二点 一分。C o

28、p y N u m b e r v s. Ct - Sta n d a r d C u r v ey = -3 .31 9 2x + 3 9 .77 2R2 = 0 .9 9 6 7051 01 52 02 53 03 54 001234567891 01 1Lo g o f co p y nu m b er (1 0n)CtThreshold Cycle, Ct, is a reliable indicator of initial copy number利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线

29、上计算出该样品的起始拷贝数。第56页/共76页第五十六页，编辑于星期五：十二点 一分。第57页/共76页第五十七页，编辑于星期五：十二点 一分。Absolute and Relative quantificationQuantification第58页/共76页第五十八页，编辑于星期五：十二点 一分。Normalization of RT-PCR using reference genesD e t e r m i n e s c h a n g e s i n s t e a d y s t a t e transcription of a gene or genesE x p r e s

30、s i o n o f t h e g e n e / s o f i n t e r e s t i s n o r m a l i z e d a g a i n s t a r e f e r e n c e g e n e / s (housekeeping gene/s) with no or insignificant expression variationE x a m p l e s o f s o m e r e f e r e n c e genes/housekeeping genes used : b-Actin, GAPDH, 18s rRNA b-2 Micro

31、globulin, Cyclophilins第59页/共76页第五十九页，编辑于星期五：十二点 一分。Beta-Actin Ornithine decarboxylase (ODC)S-adenysyl methionine decarboxylase (SAMDC)Human Prostate and Thymus第60页/共76页第六十页，编辑于星期五：十二点 一分。Beta-ActinODCSAMDCProstate Ct : 23.25 Thymus Ct : 26.93Prostate Ct : 23.10 Thymus Ct : 25.53Prostate Ct : 21.25Th

32、ymus Ct : 21.90第61页/共76页第六十一页，编辑于星期五：十二点 一分。第62页/共76页第六十二页，编辑于星期五：十二点 一分。 Only possible with DNA Binding dyes (SYBR Green I) and after completed real time PCR Determines the temperature at which 50% of the DNA molecules separate into two strands - or “melts” apartDiscriminates by Melting Temperature

33、 (Tm), Tm is dependent on:- sequence (G/C content)- lengthWhat is Melt Curve Analysis?第63页/共76页第六十三页，编辑于星期五：十二点 一分。Fluorescence vs. Temperaturechange in fluorescencesingle amplified productTm第64页/共76页第六十四页，编辑于星期五：十二点 一分。Melt curve showing two amplified productsTwo amplified productsTmTmMelt CurveChe

34、ck specificity of the reaction第65页/共76页第六十五页，编辑于星期五：十二点 一分。Collecting at Higher Temperatures; does that work to avoid detection of primer dimers?Collecting at 82 C would record specific product only Primer Dimers Impact on the Assay第66页/共76页第六十六页，编辑于星期五：十二点 一分。Outline Real Time PCR and Conventional PCR Introduction to Quantitative PCR Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory Laboratory Technique Primer Design for Real-Time PCR第67页/共76页第六十七页，编辑于星期五：十二点 一分。Laboratory Technique第68页/共76页第六十八页，编辑于星期五：十二点 一分。 Do not underestimate the importance of using:Screw ca