GBS核酸检测学习课程

1、GBS概述概述第1页/共33页第一页，编辑于星期五：二十点 三十二分。GBS概述概述 B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS)学名无乳链球菌，革兰氏阳性链球菌，正常寄居于阴道和直肠，属于条件致病菌。 在20世纪70年代，GBS已被证实为围产期母婴感染的主要致病菌之一，在围产医学中占有不可忽视的地位。第2页/共33页第二页，编辑于星期五：二十点 三十二分。什么是围产期什么是围产期 国外研究表明 ，不同地区、不同种族的妊娠晚期妇女GBS带菌率约为6.536.0，国内报道的妊娠妇女GBS带菌率为3.5%32.4，新生儿体表带菌率与母体带菌率相似。在一些特殊人群，如肥胖、糖耐量

2、异常、多次妊娠以及性生活活跃的妇女中带菌率较高。人群人群GBS带菌率带菌率 是指怀孕28 周到产后一周这一分娩前后的重要时期 围产期保健是指产前、产时和产后的一段时间内，对母亲、胎儿和新生儿进行一系列的保健工作，使母亲健康和胎儿、新生儿的成长发育得到很好的保护。第3页/共33页第三页，编辑于星期五：二十点 三十二分。GBS对孕妇的影响对孕妇的影响 GBS感染是胎膜早破的重要发病因素感染是胎膜早破的重要发病因素 GBS对绒毛膜有较强吸附能力和穿透能力，接种2小时内即可吸附于母体组织，继而侵入绒毛膜，通过炎症细胞的吞噬作用及细菌产生的蛋白水解酶的直接侵袭，使胎膜局部张力减低，从而导致胎膜早破 。

3、GBS生殖道感染是导致早产的重要因素生殖道感染是导致早产的重要因素 GBS引起泌尿生殖道感染时，会引起磷脂酶A2和前列腺素及细胞因子的释放，刺激子宫收缩导致早产。GBS是造成产褥感染的主要致病菌之一是造成产褥感染的主要致病菌之一 产褥感染是指分娩时及产褥期生殖道受病原体感染，引起局部和全身的炎性应化。产褥感染发病率为1%7.2%，是产妇死亡的原因之一 。第4页/共33页第四页，编辑于星期五：二十点 三十二分。GBS对新生儿的影响对新生儿的影响GBS感染是新生儿感染的主要原因感染是新生儿感染的主要原因早发型感染早发型感染 n多见于出生后1周内。n母婴垂直传播是其主要传播途径。n主要临床表现为败血

4、症（80%）、肺炎（7%）、脑膜炎（6%）；若治疗不及时，可引发远期后遗症，如智力发育迟缓、视觉听觉丧失等。 晚发型感染晚发型感染n 多发生于出生1周后。n 主要为水平传播：可能与院内感染或家庭接触有关。n 常呈隐匿性发病，其特征表现为脑膜炎；1/3的晚发型疾病出现脑膜炎，故这些生存下来的新生儿中更易发生神经系统后遗症。第5页/共33页第五页，编辑于星期五：二十点 三十二分。GBS的传播与感染的传播与感染感染GBS产妇 未传染给新生儿3060%传染给新生儿40%70%无症状97%早发性疾病：败血症，肺炎或脑膜炎1%3%5%会导致死亡第6页/共33页第六页，编辑于星期五：二十点 三十二分。国内外

5、国内外GBS筛查现状筛查现状美国疾病控制中心(CDC) 制定了围产期GBS预防指南该指南已经获得以下认可：p美国妇产科学院p美国儿科学会p美国护士助产士协会p美国家庭医生协会p美国微生物学会p美国流行病学会p美国药理学会在我国，2011年，中华医学会妇产科学分会产科学组在孕前和孕期保健指南(第1版)中已将B族链球菌筛查作为一个备查项目。第7页/共33页第七页，编辑于星期五：二十点 三十二分。围产期围产期GBS预防指南预防指南指出指出对所有孕妇于妊娠3537 周进行GBS筛查，结果阳性者进行预防性治疗以下情况应进行预防性治疗 ：p本次妊娠有GBS 菌尿p上次新生儿GBS 感染史p 在妊娠37 周

6、之前分娩p 破膜时间超过18小时p 分娩体温超过38.0度第8页/共33页第八页，编辑于星期五：二十点 三十二分。GBS的筛查与预防的筛查与预防阳性(+)或产时高危因素：早产，产时发热38 ，胎膜早破18小时不需要抗生素预防孕35-37周取阴道和直肠拭子作GBS检测阳性(+)抗生素预防未检测阴性()临产后GBS检测阴性( )且无产时高危因素抗生素预防第9页/共33页第九页，编辑于星期五：二十点 三十二分。预防预防GBS疾病的抗生素使用方案举例疾病的抗生素使用方案举例:围产期GBS预防指南指出： GBS阳性患者应用抗生素进行预防性治疗阳性患者应用抗生素进行预防性治疗 Boyer在1989年研究中

7、指出，产时氨苄青霉素使用超过1小时就可以使得新生儿感染从28%减少到4%。LIN在2001年的研究中表明，与无产时应用抗生素相比，抗生素预防超过2小时的有效率是89%，不足2小时的有效率为71%。挑战：我妈妈会进行IAP治疗吗？第10页/共33页第十页，编辑于星期五：二十点 三十二分。有无青霉素过敏否是青霉素G，首次剂量500万单位（静脉注射）然后每4小时250300万单位，直至分娩或者氨苄青霉素，首次剂量2g（静脉注射），然后每4个小时1g，直到分娩病人在接受青霉素或头孢菌素时有无出现下列任一症状？过敏症、血管性水肿、呼吸窘迫、荨麻疹否是头孢唑啉，首次剂量2G，然后每8个小时1g，直到分娩红

8、霉素和克林霉素治疗是否有效否是万古霉素每12小时1g（静脉注射）直至分娩克林霉素每8小时900mg（静脉注射）直至分娩围产期GBS预防指南第11页/共33页第十一页，编辑于星期五：二十点 三十二分。GBS检测方法比较检测方法比较方法学具体方法优势劣势细菌培养选择肉汤培养液18-24h，血平皿培养18-36h；后 续 药 敏 学 实 验 ：STAEP签定板条培养4-24h后，药敏学分析。结果判读直观，易开展，成本低，可进行药敏学分析。周期长（18-60h)，特别不适合临产时孕妇不知道自身是否有GBS感染的情况；灵敏度较低；实验操作人员需要较深的经验。细菌抗原检 测乳胶微粒凝集试验、协同凝集试验、

9、对流免疫电泳试验及酶联免疫试验等。操作比培养法简便，成本低。由于B族链球菌血清型较多，容易造成漏检，灵敏度相对较低。荧光PCR方法检测荧光探针，PCR法扩增核酸。采用的是所有B族链球菌cfb基因保守序列，所有GBS都存在；灵敏度最高，出结果快（2h），操作简单。需要专门的PCR实验室及荧光PCR仪。第12页/共33页第十二页，编辑于星期五：二十点 三十二分。PCR介绍介绍第13页/共33页第十三页，编辑于星期五：二十点 三十二分。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段；可看作生物体外的特殊DNA复制。

10、 什么是什么是PCR PCR原理原理PCR一般由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：DNA变性变性：（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 。退火退火 ：（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 延伸延伸：（70-75）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3端5端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍;23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 第14页/共33页第十四页，编辑于星期五：二十点 三十二分。PCR原理原理变性，退火，延伸一次循环二次循环三次循环第15页/共33页第十

11、五页，编辑于星期五：二十点 三十二分。PCR反应体系反应体系PCR反应体系中的主要试剂有： 缓冲液缓冲液 一般酶试剂会有配套缓冲液，通常含有Mg2+dNTP通常包括通常包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP引物引物与待扩增DNA链互补的DNA片段纯化水纯化水水的纯度要求很高，最好只有水分子，不含其它成份酶酶一般为Taq酶模板模板待扩增DNA链第16页/共33页第十六页，编辑于星期五：二十点 三十二分。PCR扩增仪扩增仪 PCR温度循环至关重要，PCR扩增仪各参数必须准确。 现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售PCR扩增仪。国外厂家：Bio-Rad，ABI, Roche 国内厂家：

12、杭州朗基 ，杭州博日第17页/共33页第十七页，编辑于星期五：二十点 三十二分。PCR反应特点反应特点特异性强特异性强：引物与模板DNA特异正确结合 ，碱基配对原则 ，Taq DNA聚合酶忠实性扩增灵敏度高灵敏度高 ：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（g=10-6）水平 简便快速简便快速：一般在14 小时完成扩增反应 模板纯度要求低模板纯度要求低 ：不需要分离病毒/细菌/培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板 第18页/共33页第十八页，编辑于星期五：二十点 三十二分。1. 每扩增一条DNA链，就切断一个探针2. 每切断一

13、个探针，就产生一个单位荧光信号3. 荧光信号强度与结合探针的DNA分子数成正比实时荧光PCR技术：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对模板进行分析的方法。 第19页/共33页第十九页，编辑于星期五：二十点 三十二分。GBS核酸检测产品核酸检测产品第20页/共33页第二十页，编辑于星期五：二十点 三十二分。荧光荧光PCRPCR检测检测B B族链球菌（族链球菌（GBSGBS） 第21页/共33页第二十一页，编辑于星期五：二十点 三十二分。B B族链球菌族链球菌(GBS)(GBS)核酸检测试剂盒核酸检测试剂盒(PCR-(PCR-荧光探针法荧

14、光探针法) )第22页/共33页第二十二页，编辑于星期五：二十点 三十二分。 Taqman 探针实时PCR技术 选择B族链球菌基因组特异且无高频SNP位点的序列区域cAMP因子，设计特异性引物和探针 内参照系统排除PCR反应过程中可能的假阴性结果 UNG酶避免扩增污染物造成的假阳性 适用仪器：Roche LightCycler 480，ABI 7500，Bioer Line-Gene K等多色荧光PCR仪产品特点产品特点第23页/共33页第二十三页，编辑于星期五：二十点 三十二分。规格：20人份/盒有效期：18 以下避光保存6个月试剂：DNA提取液、GBS PCR反应液、GBS阳性对照品，空白

15、对照品标本类型：生殖道/直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本试剂盒介绍试剂盒介绍第24页/共33页第二十四页，编辑于星期五：二十点 三十二分。 溶血样本、保妇康栓、皮炎平对检测结果有显著影响，应尽量避免这些样本的检测。 其他常见干扰物质（粘液和脓液）以及常用药物（青霉素G、阿奇霉素、强力霉素及氧氟沙星、聚甲酚磺醛溶液、洁尔阴洗液、黄硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、肛泰软膏、开塞露）均无明显影响。待测样本在2-8保存不应超过24小时；-18以下保存不超过4天。标本要求标本要求标本标本保存保存第25页/共33页第二十五页，编辑于星期五：二十点 三十二分。检测流程（检测流程（ 2 h ）35 min5 min

16、1h 10minn PCR扩增n 结果分析n 分装GBS PCR反应液n 加DNA模板PCR反应体系配制PCR扩增及结果分析DNA 提取n 标本n GBS阳性对照品n 空白对照品第26页/共33页第二十六页，编辑于星期五：二十点 三十二分。DNA提取提取1mL标本沉淀+1mL生理盐水沉淀+ 50L DNA提取液99-100 加热10min取上清至1.5mL离心管中保存13,000 rpm 10 min13,000 rpm 5 min13,000 rpm 10 min标本，GBS阳性对照品，空白对照品均需要提取DNA。第27页/共33页第二十七页，编辑于星期五：二十点 三十二分。PCR体系配制体

17、系配制40 L 体系：体系：35 L PCR反应液反应液 + 5 L DNA模板模板PCR扩增扩增程序： 50 2min 95 5min（ 95 15s60 35s ）45 cycles实时监测PCR扩增过程FAM 通道 HEX通道第28页/共33页第二十八页，编辑于星期五：二十点 三十二分。 FAM通道检测结果：分析样本，空白对照品： Ct值不显示；阳性对照品： Ct30.00； HEX通道检测结果： 分析内参照基因，Ct35.00 阴性阴性：样品的FAM通道无Ct值显示, HEX通道Ct35.00 阳性阳性： 样品的FAM通道 Ct38.00， HEX通道Ct35.00备注备注：若样品的F

18、AM通道 38.00Ct45.00，建议重新检测该样本， 若重检结果仍为38.00Ct45.00或Ct38.00，判定为阳性阳性； 若Ct不显示且HEX通道Ct35.00，判定为阴性阴性。结果有效性判定结果有效性判定结果分析结果分析以上要求需在同一次实验中同时满足以上要求需在同一次实验中同时满足第29页/共33页第二十九页，编辑于星期五：二十点 三十二分。产品优势一产品优势一 灵敏度高：灵敏度高：采用PCR方法检测DNA，试剂与国际领先试剂性能相同 特异性强：特异性强：不与临床常见其它各类病原体产生交叉反应 稳定性好：稳定性好：样本DNA提取质量高，阳性对照品、空白对照品内参基因扩增曲线高度吻合，试剂稳定 无污染：无污染：全封闭PCR体系，避免实验室其它PCR产物污染 易操作：易操作：操作简便，采用预制PCR反应液，无需额外加入内参照基因、酶等 速度快：速度快：检测周期短，从核酸提取到PCR结束实验过程不到2小时第30页/共33页第三十页，编辑于星期五：二十点 三十二分。产品优势二产品优势二 公司GB