微生物学实验指导：生活污水（含药厂废水）的细菌学检查（综合性实验）

1、实验一生活污水(含药厂废水)的细菌学检查(综合性实验)实验目的：1. 学习水样的采取方法和水样中细茵总数测定的方法2 了解水源水的平板菌落计数的原则3. 了解pcr技术监测污染水体大肠埃希菌的意义和基本原理4. 掌握pcr操作技术实验材料：1培养基牛肉膏蛋口ii东琼脂培养基。2. 材料水样3. 仪器及其他用具 恒温培养箱、三角烧瓶，带玻璃塞瓶，培养皿，移液器(iml),移液 管(iml),试管等，pcr仪，水浴锅,培养箱，电泳仪，自动微最移液器(各型号)，滤膜, pcr管，离心管，whatman 3mm滤纸或相当产品。4. 试剂及溶液 含有适当抗菌素的lb培养基，taq dna聚合酶，正向引物

2、(20pmol/l) 及反向引物(20pmol/l)溶于水中，dna分了量标准，乙酸钱(10mol/l),无水乙醇，tsel(50mmol/ltris-hcl, ph8.o, 20%廉糖，50mmol/ledta, 1 pg/pl 溶菌腮)，ssk (50mmol/lnacl, 1%sds, 3mg/ml 蛋口酶 k),te 缓冲液,10x扩增缓冲液(500mmol/lkcl, 100 mmol/ltris-hcl, 15mmol/l, mgcl2)o4种dntp贮存液(20mmol/l, ph8.(),琼脂糖溶液(0.7%),电泳缓冲液(1xtae),澳 化乙锭染色液，6x凝胶上样缓冲液。4

3、.仪器及其他用具实验原理：本实验采用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。山于水中细菌种类繁多，它们对营养 和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌 均能生长繁殖。因此，以一定的培养基平板上生长出來的菌落计算得到的水中细菌总数仅是 一种近似值。目前-般是采用牛肉膏蛋白豚琼脂培养基测定水屮细菌总数。大肠埃希菌(escherichia coll )是指示粪便污染的重要指示物。当水体中出现人量的e. coli就说明近期内水体受到了粪便污染(因其脱离寄主后，其半存留期会大人缩短)。pcr 检测这种微生物非常灵敏，即使每looml水中只有一个个体，也能被检验出来。实验

4、内容：(-)细菌总数测定自来水(1) 用灭菌移液管或移液器吸取iml水样，注入灭菌培养hll'l'o(2) 分别倾注约15ml已融化并冷却到45°c左右的牛肉膏蛋l1j东琼脂培养基，并立即在 桌上作平而旋摇，使水样与培养基充分混匀。(3) 另取一空的灭菌培养皿，倾注牛肉膏蛋白丿陈琼脂培养基15nil,作空白对照。(4) 培养基凝固后，倒置于37°c温箱中，培养24h,进行菌落计数。两个平板的平均菌 落数即为iml水样的细菌总数。池水、河水或湖水等(1) 稀释水样：取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取iml水样注入第一管9ml 灭菌水内、摇匀，再自笫一管

5、取iml至下一管灭菌水内，如此稀释到笫三管，稀释度 分别为10，io-'与10'稀释倍数看水样污染程度而定，以培养后平板的菌落数在 30-300个z间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计 数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污染水样，取10，10巴10-3三个连续稀 释度，污染严重的取103 10-3, 1()4三个连续稀释度。(2) 自授后三个稀释度的试管中各取iml稀释水加入空的灭菌培养皿中。每一稀释度做 两个培养血。(3) 各倾注15ml己融化并冷却至50°c左右的牛肉膏蛋口月东琼脂培养基，立即放在桌上 摇匀。(4) 凝固后倒置于3

6、7°c培养箱中培养24h.o菌落计数方法先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用, 而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。(2) 选择平均菌落数在303()0之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围吋，则 以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。(3) 若冇两个稀释度的平均菌落数均在30300 z间，则按两者菌落总数z比值來决定。若 其比值小于2,应采取两者的平均数；若人于2,则取其中较小的菌落总数。(4) 若所有稀釋度的平均菌落数均人于300,则应按稀禅度最髙的平均菌落数乘以稀释倍(5) 若所有稀释度的平均菌落数均小于

7、30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。 若所有稀释度的平均菌落数均不在3()3()()之间，则以”近30()或3()的平均菌落数乘以稀释倍数。(-)应用pcr技术监测污染水体大肠埃希菌1. 水样的处理及模板dna的制备(1)取水样iml,低速(2 ()0() r/min )离心5min,以除去不溶性杂质。取出上清，经6 000 r/niin 离心5min,收集菌体。 将菌体悬于100 pltsel溶液中，置37°c水浴作用30 mine 向反应混合物屮加入300wssk溶液，置37°c继续作rj 60 min0 向反应混合物中加入2倍体积的无水乙醇，摇匀后置-20

8、°c,2h. 12 000 r/min 心15 min, 收集沉淀，室温晾干后将沉淀物溶于100-30011无菌去离子水或te缓冲液中备用。如果是纯培养的菌落，即将菌落挑入100pl无菌去离了水中，加热煮沸lmin,即可作为 pcr模板。2. 引物设计本实验的引物来自e. coli的加z和cim b基因。lac z 引物 1： zl-1675 (5'atgaaagctggctacaggaaggcc3)引物 2： zr-2025 (5,-ggtttatgcagcaacgagacgtca-3*)lam b 引物 1： bl-4910(5,-ctgatcgaatggctgccaggctcc-3,)引物 2： br-5219 (5*-caaccagacgatagttatcacgca-3*)3. pcr扩增体系按以下次序，将各成分加在().5mlpcr薄壁管内混合:10x扩增缓冲液5卩120mmol/l4 种 dntp 混合液(ph&o) 1川20|imol/l ie向引物 2.5|il20|imol/l 反向引物 2.5|11模板 dna5l()pltaq dna聚合酶12单位补足h2o至总体积50)114. pcr循环按以下方法进行pcr扩增，典型的程序有变性、复性和聚合(延伸反