BDFACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤corrZY

1、B D F A C S C a l i b u r流 式 细 胞 仪简易操作步骤一、开机1） 先打开净化交流稳压电源，其次打开 110V 稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最后打开计算机。2） 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色箭头所示）方向调在VENT 位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的3/4 左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN 位置。二、开启CellQuest软件、编辑实验文件1）在屏幕下方点击CELLQuest （第四个图标）启动软件。桌面会出现一 Untitled实验文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文

2、件窗口放大。2）从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。3）在出现的散点图对话方框中点击PlotSource ，选择 AcquisitionandAnalysis(收取、分析 )，确认 X 和 Y 轴参数预设为FSC-H1024 、 SSC-H1024 。4）从屏幕上方Plots 菜单中选择DotPlot 功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X 轴： FL1-H1024 ；如果是双标，Y 轴选择： FL2-H1024( 根据实验检测样品确定所选通道，本步

3、骤选FL1/FL2 来说明 )，如果是单标，Y 轴选择： SSC-H 。点击 OK ，FL1/FL2 的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。说明： 散点图（ Dotplot ），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中，横坐标X 轴和纵坐标Y 轴参数分别设为FSC-H1024 、 SSC-H1024 ；双荧光标记时，第二图X 和 Y 轴参数分别设为FL1-H1024 、 FL2-H1024 ， X 轴为为荧光 1 强度的相对值，单位是道数，Y 轴则通常表示荧光2 或光散射强度的相对值。仪器使用者可因实验需求来修改所有图谱中显示之参数。修改动作为轻击图谱

4、上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC ：细胞大小， SSC ：细胞折射率，FL1 ： FITC 绿色荧光，FL2 ：PE 橙色荧光， FL3 ： PerCP 红色荧光）。5）在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2 散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）（ 10 1， 10 1）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。6）从工具板中点击直方图图示，在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。单色荧光只需一个直方图，和第二个散点图一样，横坐标选择FL-1 ，纵坐标默认为Counts ；若是双色荧光，需画2 个直方图，一个横坐标选择FL-1-1024 ，另一个横坐标选

5、择 FL-2-1024 ；7 ）在上面直方图中画出 M1 和 M2 ，其中 M1 代表隐性数目（一般标示是101）， M2 代表阳性数目（除 M1 以外所有的部分）。8）从 Stats 菜单中选择QuadrantStats （象限统计）,5）步骤中的点图将分为四个象限。三、建立仪器和计算机之间通讯从 Acquire 菜单中选择 ConnecttoCytometer( 快捷键 Win+b) ，此时会出现AcquisitionControl对话方框。四、仪器设置文件注意： 实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器

6、设定文件（ Instrumentsettings ），含信号器高压（ Detector/Amps ），阈值（ Threshold ），荧光补偿（ Compensation）等仪器条件的组合。一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps-Threshold-Compensation。1）检查现有仪器条件，从 Cytometer 菜单中选择 Detectors/Amps 。出现 Detectors/Amps 窗口。在 Detectors/Amps 窗口确认 FSC 与 SSC （根据实验样品确定，一般细胞选择 LIN ，细菌选择 LOG ），其它 FL1-3 为LOG （对数放大），将其拖

7、至空白区。2）从 Cytometer菜单中选择Threshold ，出现 Threshold窗口在 Threshold窗口：确认FSC 为设阈参数，初步确认预设阈值52 。将其拖至空白区。3）从 Cytometer 菜单中选择 Compensation ，确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白区。五、上样品、设置仪器使仪器处于HighRUN ，样品管支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认AcquisitionControl窗口中Setup 前需打叉或打勾(即不储存数据，用于仪器设置)，点击 Acquire 。1 、调节 FSC/SSC探测器（电压）观察 FSC/SSC图的变化。 FSC

8、电压 (Voltage) 预设为 E00 ，可调节AmpGain从 1.00 9.99 使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC 电压设置于E-1 ；较小细胞，将FSC 电压设置于E01 ）。调节SSC 电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC 图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击 AcquisitionControl 窗口中的 Pause 。2 、 Gating圈选细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射（FSC ）与侧方散射（ SSC ）的二维位图，即散射光图谱（ ScatterPlot

9、），来圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。1）在工具板中选择多边形的Region ，在 FSC/SSC 散点图上划定淋巴细胞R1 区域（如下图）。分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。如果要删除R1 区域，您可以在工具列中点选Gates Regionlist，以鼠标点选R1 ，再按 Delete 键删除 R1 区域。删除R1 区域后，可用绘图工具板，重画R1 。2） 选取希望Gate 的 FL1/FL2 散点图，从Plots 菜单中选择Formatdotplot。在出现的对话方框内，将NoGate 改选 G1

10、=R1 。点击 OK 。3 、调节FL1 、 FL2的探测器（电压）1 ）点击 AcquisitionControl窗口中的Restart 。在 Detector/Amps窗口中调节FL1 、 FL2的电压，使NegativeControl细胞群着落在所选直方图或散点图之10 0-10 1 处。2）在 Threshold 窗口，适当地提高 FSC 阈值 >52 ，以去除碎片或低阶噪音。唯需注意不要切掉主要细胞族群。3）点击 AcquisitionControl窗口中的 Pause 、 Abort 。移去阴性对照管，我们已设定好有意义细胞群之自体荧光，不要再改动Detector/Amps、

11、Threshold等数值。4 、调节荧光补偿说明：最适化的最后一步是调节光谱重迭。（如是单色荧光实验可跳过此步骤）如是样本，必要时需调节FL2-%FL1 ， FL1-%FL2 （若 3 色样本，必要时需调节FL2-%FL1FL1-%FL2 、 FL3-%FL2 、 FL2-%FL3的补偿）。2 色、1）HighRUN窗口中的，换上单染CD3-FITC管。点击AcquisitionControlAcquire 。调节 FL2-%FL1使 FITC 阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。补偿调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。调节完毕，点击窗口中的 Pause 。Acquisition

12、Control2）移去单染CD3 ，换上单染CD19-PE管。点击AcquisitionControl窗口中的Restart 。调节 FL1-%FL2细胞在 FL1/FL2 散点图的左上象限。调节完毕，点击使 PE+AcquisitionControl窗口中的Pause 。3. ）最后以 CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机，点击AcquisitionControl窗口中的 Restart ，确定三群细胞工整垂直。当您已完成2 色荧光之光谱重迭时，点击AcquisitionControl窗口中的 Pause 、 Abort 。4）移去样本管，换上dH2O 管，让仪器暂且处于Standb

13、y状态。关闭Compensation窗口。您已完成2 色荧光之最适化。六、收集实验数据1）决定储存细胞总数：预设之储存细胞总数为 10000 中选择 Acquisition&Storage ，并在出现的窗口功，确认。如需修改，从AcquireCollectionCriteria从菜单10000ofAll，再点击OK 。2） 找个档案匣准备储存数据，本机所有数据都贮存在D 盘 data 盘中，按实验日期编排 。 从 Acquire 菜单中选择ParameterDescription，出现 ParameterDescription对话方框。点击Folder ，并在随后出现之对话方框，选择Y

14、ourFolder 或新建活页夹，点击此对话方框的Select YourFolder（一般用实验日期来命名Folder ）。3）命名即将储存之文件名：点击ParameterDescription对话方框的File ，出现文件名编辑窗口，输入文件名（根据实验来决定），点击此对话方框的OK。4） Optional ：如有需要，可选择或在P1-P5 后的空格中输入相关参数名。如P1 ：Size,P2 ： Granularity,P3： CD3FITC 。输入参数名会存入实验档案中，显示在图谱上。5 ）计数器 Counters ：从 Acquire 菜单中选择 Counters. 窗口会显示样品分析速

15、率、与总数进度6 ）开始收集实验数据。 LOWRUN （根据Counters来调节速度，一般保持在700-800/Second ），将第一管样品放到检测区，在AcquisitionControl窗口中，将Setup改成Setup ，此时CellQuest会自动显示YourFolder文件名为资料文件名。点击“ Acquire ”便可启动样品之分析测定与数据储存。当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据文件文件名 .001 ，并会以“嘟”声告知， CellQuest 会自动升幂附加档名成文件名 .002 。等待下一指示。7）换上超纯水，清洗管路，直到 Counters 持续显示 0/Second30s( 约为 10-20s) ，换上下一管样品，点击“ Acquire ”启动样品之分析测定与数据储存。可继续分析直到所有检品都分析完毕。七、退出软件并关机1） .检品分析完毕后，记得从屏幕上方File 指令栏选择SaveAs ，储存实验文件，以备日后使用，不需每次重新编辑。2）检品分析完毕后，用鼠标从屏幕上方Acquire 指令栏中，选取DisconnecttoCytometer以断绝计算机与仪器间之联机。之后如不分析数据，您可退出软件“File ”“ Quit ”(遇有选项永远选择“Don tsav