南方医科大学-血清分离和提纯-级临床医学二-第7实验室

1、南方医科大学-血清分离和提纯-2015级临床医学二-第7实验室南方雇耕大学生物化学实验报告姓 名:学 号专业年级生物化学及分子生物学实验教学中心6 / 14实验名称血清清蛋白、丫-球蛋白的分离纯化及定量实验日期2016年11月17日 实验地点 第7实验室指导老师尹红评分教师签名批改日期一、实验目的1.掌握凝胶层析法、盐析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法；掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基础方法；3. 了解柱层析技术的原理和相应操作二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技 术观察蛋白质分离1 .盐析蛋

2、白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素即表面的电 荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚 集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定 因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物 碱试剂法等。盐析法的原理是：中性盐如硫酸镂（NHJ2SOJ等对蛋白 质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白 质相互聚集而析出。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电 荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐 的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清球蛋白在半 饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全

3、饱和状态下沉淀，利用此 特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀， 而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸 镭水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。2 .脱盐盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质 遗留的中性盐常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法 脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质及盐的分子量不同，当样品通过层 析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿 着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先 流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒， 所以流程长，

4、向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。分段收集 蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。3 .纯化（离子交换层析）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过 程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳 离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷 的离子可及其进行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这 样便可达到分离纯化的目的。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可 进行分离。血清中各种蛋白质的pl各不相同，因此，在同一醋酸镂缓 冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血 清清蛋白和伽马

5、球蛋白分离出来。4 .纯度鉴定（电泳）血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于PH7.4。它们在 PH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆 中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维 素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白 （Albumin） a 1-球蛋白、a 2-球蛋白、B-球蛋白、丫-球蛋白5条 区带。三、材料及方法：（一）材料人血清试剂饱和硫酸核溶液0. 02mol/l pH值为6. 5的醋酸镂缓冲液0. 06mol/l的PH值为6. 5醋酸镂缓冲液南方医科大学-血清分离和提纯-2015级临床医学二-第7实验室0. 3mol/l的

6、PH值为6. 5醋酸镂缓冲液1. 5mol/l 的 NaCl-0. Smol/NHAc 溶液20%磺基水杨酸l%BaC1溶液仪器和器材二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱和葡聚糖凝胶 G-25(Sephadex G-25)层析柱烧杯、1ml和10ml的吸管、滴管、试管、 黑色反应板、铁固定架、螺旋夹电泳槽和电泳仪除去盐离子后收集的球蛋白过DEAE-纤维素层析柱 （lcmX6cm）用 3 毫升 0.02mol/l pH=6.5、 的醋酸铁缓冲液洗脱，流出液量2毫升,用 3 毫升 0.02mol/l pH=6.5、 的醋酸铉缓冲液洗月感 流出液量2毫升收集含有蛋白的洗脱液每、 管10滴，

7、连续收集三管DEAE-纤维素柱不用再生，可直1”除去盐离子后收集的球蛋白过DEAE-纤维素层析柱（IcmX 6cm）用1毫升0.06mol/l醋酸镂缓冲 液（2毫升）洗脱，流出液量2 毫升（用5毫升0.06mol/l醋酸核缓冲 液流洗，除掉a球蛋白、B球蛋6 / 14 1）（南方医科大学-血清分离和提纯-2015级临床医学二-第7实验室步骤操作现象(1)盐析取离心管一个，加入0. 8mol人或动物血清， 边摇边缓慢滴入饱和硫酸镀溶液0. 8ml,混匀 后室温下放置lOmin ,离心lOmin (4000r/min) o用滴管小心吸出上清液置于试管中，作为纯化清蛋白之用溶液由淡黄 色透明状转 变

8、为白色浊 液，离心后 溶液分层， 上层澄清， 下层为白色 沉淀(2)溶向离心管的沉淀加入0. 6mol蒸镭水，振摇使白色沉淀完解沉淀之溶解，作为纯化y球蛋白用全溶解，液 面有泡沫产 生步骤操作现象(1)调节层析 柱液面葡萄糖凝胶G-25层析柱经0. 02mol/L .PH6. 5 NH4AC缓冲液流洗平衡后，取下恒压 储液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夹，使层 析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面液体缓慢低 落，约每三 秒钟两滴(2)加样品用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白 质溶液，小心而缓慢的加入凝胶床上面，柱 下端用10ml刻度离心管接液，拧松柱下螺旋 夹，调节适当流速，使样品进入凝胶床，

9、至 液面降到凝胶床表面为止3 )洗层析柱小心用 0. 02mol/L> pH6. 5 NH4AC 缓冲液 洗涤层析柱内壁，以洗涤粘在柱壁上的蛋白 质样品液(4)洗脱待样品液进入凝胶床内，继续用0. 02U1O1/L、PH6.5 NH4AC缓冲液流洗，同时注意流出液11(5)检测及收在黑色反应板凹孔内加2滴0. 92mol/L磺 基水杨酸，随时检查流出液是否含有蛋白质，磺基水杨酸在接受层析集蛋白质滴流出液1滴黑色反应板凹孔内接触到磺 基水杨酸溶液，若出先白色混浊或沉淀，表 示已有蛋白质流出(当凝胶床体积为5. 5ml 时，流出的液体量约为2ml就可能有蛋白质 流出)，立即收集流出的蛋白质溶

10、液。收 集约12滴后，滴流出液1滴于预先加有1滴 0. 05mol/L(l%)BaC12的黑色反应板凹孔内, 一旦见出现白色沉淀(表示有S042-),立即 停止收集收集的蛋白质溶液即可分别过 DEAE纤维素柱，进行离子交换层析柱低落液前 两次显现澄 清，第三次 产生白色沉 淀，黑色板 孔氯化钢部 分第一次即 出现白色沉 淀(6)层析柱再生平衡收集蛋白质溶液后的凝胶层析柱继续用 0. 02mol/L pH6. 5 NH4AC 缓冲液流洗，用 BaC12液检测层析柱流出液，当流出液用 BaC12检查S042-为阴性后,继续洗涤2、31nL 凝胶层析柱即可再生平衡，可再次使用氯化领部分 在连续接受

11、几次滴入后 沉淀颜色变 淡，直至完 全无沉淀 球蛋白的纯化：过DEAE纤维素阴离子交换层析柱步骤操作现象(1)调 节层析 柱换冲 液面经处理再生好的DEAE纤维素层析柱，取下其恒 压储液瓶管塞。小心控制柱下端螺旋夹，使柱 上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面。柱下端 用10ml刻度离心管收集液体，以便了解加样后 液体的流出量。2）加样ini将除除盐后收集的球蛋白溶液缓慢加到纤维 素柱上，调节层析柱下端的螺旋夹使样品进入 纤维素柱床，至液面降到纤维素柱床表面为 止。(3)洗层析柱小心用1ml 0. 02mol/L PH 6. 5的醋酸镂缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样储液。(4)洗脱待样品进入纤维素柱

12、床内，继续用0. 02mol/L PH 6. 5的醋酸镂缓冲液流洗，同时注意流出液量(5)检 测及收 集蛋白 质流洗时，随时用0. 92mol/L磺基水杨酸检查 流出液中是否含蛋白质(方法同前)当有蛋白 质出现时，立即连续收集三管，每管10滴，此 不被DEAE纤维素吸附的蛋白质即为纯化的丫- 球蛋白，取其中蛋白质浓度最高的一管留作鉴 定用。现象同前注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时, 不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加13 / 14南方医科大学-血清分离和提纯-2015级临床医学二-第7实验室 样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤

13、维素冲起或破坏纤 维素床表面平整。C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸及检查硫酸根的 氯化钢混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意 及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。e.葡萄糖凝胶价钱昂贵， 要回收再生避免损耗，严禁倒掉。步骤操作准备电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上， 两侧注入等量的巴比妥缓冲溶液，使其在 同一水平a,页面及支架距离2、2. 5cm,用 三层滤纸或双层纱布搭桥薄膜准备将醋酸纤维薄膜裁成2cm乘以8cm大小共 四段，在薄膜一段1. 5cm处用铅笔轻轻画 上一条横线为点样线，末端用铅笔做记号。 进入巴比妥溶液中直至浸润完全。用镶子 青青取出，粗面朝上，平放在两层

14、干滤纸 中间，轻轻拭去多余的缓冲液。醋酸纤维膜有 光面和粗面两 面，粗面呈现哑 光样，在此面做 标记点样薄膜片置于干净的玻璃或滤纸片上，粗 面朝上，用玻片或载玻片一段的截面在盛 有样品的直接沾取2“3微升待测品，让后 将样品及薄膜点样先轻轻接触，均匀分布 在点样线上，带样品渗入薄膜后移开，四 种样品分别点样。接触后无明显现象电泳将已点好的样品薄膜放在铺有滤纸盐桥的14 / 14南方医科大学-血清分离和提纯-2015级临床医学二-第7实验室电泳槽上，点样面朝下，点样端至阴极， 轻轻拉平薄膜。平衡约5min,使缓冲液渗 透大道平衡。接好电路，调节电压开始电 泳。待各个样品没有变化停止电泳，并轻 轻

15、取出。染色漂洗和鉴将染色液倒入大培养皿中，电泳完毕后用 镜子取出薄膜，直接浸入染色约5min。后 将薄膜取出，漂洗至背景无色，观察电泳 情况醋酸纤维膜洗 脱后表面呈现 出蓝色条带，条 带样见下文实验过程中的现象已于上各表中列出 四、结果及讨论：实验结果如图所示：A根据相同类型蛋白质有相同电泳距离的规律，本组判定：图中B组为 人血清的电泳结果，A, C, D三组及B组比较判定：图中从左至右分别为丫-球蛋白、血清样本、清蛋白2和清蛋白1的电 泳结果。对结果的讨论：1、图中可以看出清蛋白2的电泳调到在最深色条带之前有少不明显的 染色区段，该现象的原因可能为该条带的点样为首次分理出的清蛋白 还含有少数

16、球蛋白，故在电泳时停留在这些区段而显色。2、图中清蛋白1及血清样的条带有些许弯曲，该现象可能是由于点样 是点样用盖玻片边缘宽度过宽导致边缘效应的产生。还可能由于点样 过多导致点样区不均匀造成。3、有某些组的显色结果不明显或不显色，这可能是由于点样过少造成。思考题：1 .硫酸镀盐析一步,为什么是0. 8ml血清加0. 8ml饱和硫酸锈？半饱和状态下的血清球蛋白在硫酸铁溶液中将沉淀，血清清蛋白在不 饱和的硫酸镀溶液中溶解，将血清和饱和硫酸铁等体积混合后，配出 半饱和的硫酸铁溶液，在此状态下，球蛋白沉淀，而清蛋白不沉淀，16 / 14南方医科大学-血清分离和提纯-2015级临床医学二-第7实验室 因而可以将其分开。2 .为什么实验中DEAE纤维素柱分离丫-球蛋白后不用再生，可直接用 于纯化清蛋白？答：丫-球蛋白为带正电荷蛋白，故不在DEAE中结合而直接从层析柱 中洗脱出来，造成两种蛋白的流出速度不同所以分离丫-球蛋白后可直 接用于纯化清蛋白。3 .应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴