[精品]酶的固定化技术、现状及发展趋势

1、酶的固定化技术、现状及发展趋势酶的固定化固定化酶是2()世纪6()年代开始发展起来的一项新技术最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结 合起來，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾称为“水不溶酶”和“固相酶”但后來发现也可以 将臨包埋在凝胶内或置于超滤装置小，高分子底物与陋在超滤膜一边，而反应产物nj以透过膜逸出, 在这种情况下，酶木身仍是可溶的因此，用水不溶酶和固相酶的名称就不恰当了在年第一届国际酶 工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称。所谓的固定化酶，是指在一定的空间范围内起 催化作用的，并能反复和连续使用的酶。i古i化酶的出现，解决了酶在工程化应用中存在的问题。极 大地提高了酶的应用价值。酶

2、的本质是蛋白质，陋的固定化实质是具有催化活性的蛋白质的固定。没的催化活性主要依靠 他的特殊的高级结构一一活性中心。当高级结构或活性中心发牛变化时，陆的催化活性便下降，底 物的特界性也对能发牛变化，因此制备固定化酶时必须严格操作条件，尽町能避免酶的高级结构受 到损害。包埋法交联法共价法酶的固定化方法很多，主要分 为四类：即吸附法、包埋法、共价 结合法、交联法等。吸附法和共价 结合法又可称为载体结合法。吸附法1、包埋法：包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构屮这样对以防止酶蛋口释放， 但是底物仍能渗人格子内与酶相接触此法较为简便，酶分子仅仅是被包埋起來，心物活性破坏少， 但此法对

3、大分了底物不适用(1) 凝胶包埋。凝胶包埋法是将酶包埋在交联的水不溶性凝胶的空隙屮的方法交联聚丙烯加胺 凝胶包埋法是首先被采用的包埋技术。用此法固定了胰蛋白酚、木瓜蛋白陆、b淀粉陆 用此方法后来又固定了过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、b葡萄糖营酶，近年又有人使用天 然材料如藻酸盐和卡拉胶进行包埋。(2) 微胶囊包埋将酶包埋于半透性聚合体膜内，形成直径为1-loonm的微囊这种固定化酶是以 物理方法包埋在膜内的，只要底物和产物分子大小能够通过半透膜，底物和产物分子就能 够以自山扩散的方式通过膜。2、吸附法：吸附法吸附固定是最简单的方法，酶与载体之间的亲和力是范徳华力、离了键和氢键此方法又 可分为物理吸

4、附法和离子吸附法(1) 物理吸附法,使用对蛋白质具有高度吸附能力的非水溶性载体，如活性碳、几丁质、多孔玻 璃等作为吸附剂，将酶吸附到表面上使酶固定化这种方法操作简单，反应条件温和，载体 可反复使用，但结合不牢固，酶易脱落。（2）离子吸附法，利用猶蛋白在解离状态下nj用电荷引力而固着丁带有为猶蛋白电荷相异的离 子交换剂（水不溶性载体）上的固定化方法此法操作简单，固定较为牢固，在工业上用途颇广 常用的载体有阴离子交换剂.3、共价法：酶蛋白分了上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键连接的方法其优点是 酶与载体z间的连接很牢固，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻目前，已建立

5、 的方法包括.（1）重氮法，这是共价键法中使用授多的一种如下式所示，将具冇氨革的不溶性载体，以稀盐酸和亚 硝酸钠处理成为重氮化物，再与酶分子偶联酶蛋口屮的游离氨基，纽氨酸屮的咪哇基，酪氨酸 中的酚基，可与其结合。r nh2tr n 三 ncl +酶t r-n=n-酶（3）肤键法，此法是将有功能基团的载体与酚蛋白中赖氨酸的£ 一氨基或n末端的4氨基作用 形成肤键成为固定化酶。（4）烷基化法和芳基化法，以卤素为功能基团的载体与酶蛋白的氨基或琉基发生烷基化或芳基 化反应，形成固定化酶。4、交联法：使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体，交联形成 的固定化酶

6、称为交联酶与共价结合法一样，都是靠化7结合的方法使酶固定化具区别在于交联法 使用了交联剂常用的交联剂有戊二醛、蹂酸，单用戊二醛交联得到固定化酶的方法很少单独使用将 此法与吸附法或包埋法联合使用可以达到良好的加固效果，例如先用儿丁质吸附，再用戊二醛交联 等。固定化方法的选择与比较虽然发展了许多固定化技术，并用于多种酶，但现在还没冇一种能适合所冇应用和所冇酶的全 能方法因为各种酶的化学特性和组成茅别很人，底物和产物性质不同，产物的用途也不一样因此， 対固定化酶的毎一种应用來说，必须找到既简便乂廉价的方法，并且要在给出产貼的同时很好地保 超酶活性，还要有高的工作稳定性。从载体材料特性和使用各种方法所

7、获得的人量资料，可归纳岀选用固定化方法的一般依据，并 可作为某些特殊情况下的使用原则，但并不能保证i定会成功因此，必须通过多种方法的比较试验 才能找出适合的方法各种固定化方法的比较固定化方法吸附法包埋法共价键结合法交联法物理吸附法离子吸附法制备l易易较难难较难结合程度199中等强s强活力回收率高，但酶易流失高中等再生可能可能不可能不可能不可能固定牝成本低低低a中等底物专一性不变不变不变可变可变固定化酶的性质酶固定化后所引起的酶性质的改变，一般认为具原因可能有两种一是使酶本身变化二是受固 定化载体的物理或化学性质的影响所谓酶木身的变化，主要是山于活性中心的氨基酸残基、高级结 构和电荷状态等发生了

8、变化载体影响，则主要体现在固定化酶的周围，形成了能对底物产生影响的 扩散层，以及静电的相互作用等引起的。（1）温度陆被固定化以后，英最适温度比天然酶高一些，-般因輛而界，大致提高515°c范围。（2）稳定性酶经固定后，稳定性都有所增加，稳定性的提高包括对各种试剂的稳定性、对蛋口酶 的稳定性、热稳定性的存及操作稳定性等（3）ph值酶和细胞经固定化后，其最适ph及ph活性曲线冇时发生变化，冇时则不发生变化据报道，最适ph的变化是由载体的静电荷决定的，用聚合阳离子作载体，其最适ph比固定化前 向酸性一侧偏移1个ph单位，这可解释为当酚被结合到聚合阳离子载体上时，酶蛋口的阳离子数增 多，从1

9、何造成固定化酶反应区域ph值比外部溶液偏碱这样，实际上酶的反应是在反应液的ph偏碱 的一侧进行的，从而使最适ph值转移到了酸性一侧，若用聚合阴离了作载体，则与上述悄况相反， 最适ph值移向碱性一侧。酶的固定化应用现状及发展趋势1、在工业上的应用（1）高糖果浆的生产：利用含葡萄糖异构酶的固定化酶生产高果糖浆是固定化酶在工业应用方而 规模最大的项早期工业生产果葡糖浆是采用游离的葡萄糖界构酶或含有此酶的微纶物菌体 分批进行的，近年來，比蔗糖更便宜的果衙糖浆的需求量口渐增大，因此很多国家都进行了旨 在以大量和廉价住产果葡糖浆为目的的固定化葡萄糖异构酶的应川研究，并成功地实现了工 业生产（2）l-氨基酸

10、、冇机酸的生产l天门冬氨酸是最早用固定化酶在工业上大规模生产的氨棊酸所用 的固定化方法有聚内烯豔胺凝胶法、琼脂凝胶包埋法、明胶戊二醛包埋法和卡拉胶包埋法随后, 乂发展起利用固定化细胞生产l一丙氨酸。目而，可以利用固定化酶和细胞牛产的氨基酸和有机 酸还有l一谷氨酸、l一异亮氨酸、l一瓜氨酸、l一赖氨酸、l-色氨酸、l一精氨酸、乳酸、 醋酸、柠檬酸、葡萄糖酸等。2、医学方面的应用现在人们已将陆作为药物广泛地在医疗上加以应用，发展成为解疗法但用于治疗目的的酶，本 身是一种蛋白质，进人少、体后，会产生抗体，由于抗体反应，能引起患者的过帧性休克此外，作为 药物使用的酶，一般活力比较低，酶木身也不太稳定，

11、易被蛋白酶水解，失去治疗作用如果将酶制 成微小的胶囊型固定化酶再注人人体，则可以增加稳定性，并且避免与体液接触而产住抗体。例如, 一天门冬酸胺晦具有治疗白血病的作用，但天然l一天门冬酸胺酶进人人体会产生抗体，使病人出 现休克因此，需将其微囊化或川可溶性高分了如梭卬基壳聚糖对其进行修饰以降低其毒副作川，这 种修饰实际上与固定化在化学本质上是一样的。微小胶囊还适于包埋多酶系统，因而可用于代谢异 常症的治疗泣叉或制造少、工器官如人工肾脏以代替血液透析等。需要说明的是，用于体内治疗的 固定化载体或胶囊都应具冇良好的生物相容性或是可以生物降解的，以避免长期存留对人体带来的 不良影响3、坏境保护方面的应用

12、消除环境污染，保护环境，是人们普遍关心的问题，固定化酶和细胞在这方血也人有用武之地。(1) 环境监测根据固定化酶用于化学分析的原理，固定化酚也可以用于测定有毒物质含量以进 行坏境监测如定酚、有机磷、有机氯、氧化物等的监测美国宾夕法尼亚大学利用多酚氧化 酶制成固定化酶柱，将其与氧电极检测器合用，可以检测出水中2x10 5的酚(2) 处理三废人们可以利用活性污泥法来处理工业废水现在述可以从活性污泥屮分离出微生物, 然后将酚或微生物细胞本身固定，由此组成快速、高效、能连续处理的系统。例如，从处理 含鼠化物的活性污泥小分离出能分解鼠化物的细菌，然后用聚丙烯酸胺包埋、装柱，用以除 去废水中的亂化物。4、能源方面的应用牛产氢气和甲烷氮气作为一种清洁能源已引起人们的关注很多细菌和藻类在厌氧条件下都能 产生氢气但是，微生物细胞内的产氢系统很不稳定，因而很难用于连续产生氢气实验证明，微生物 细胞经固定化后，其红化酶系统的稳定性提高，能够连续产生红气例如用聚丙烯酸胺凝胶包埋丁酸 梭状芽抱杆菌ifo3847菌株，可以利用衙萄糖牛产氢气，并口稳定性好，无需隔氧近來，固定化细胞 技术在甲烷发酵屮也获得了应川。例如，用聚乙烯醇(pva)为包埋剂对甲烷八叠球菌的富集培养 物进行同定化，其处理豆制殆废水的结果表明，在低有机物负荷下，i司定化甲烷八