低磷胁迫下乙烯对小麦幼苗生理生化指标的影响

1、 实 验 论 文 题 目：低磷胁迫下乙烯对小麦幼苗生理生化指标的影响姓 名： 学 号：      院 系： 生命科学与农学学院 专 业： 生物技术 年级班级： 2012级生物技术 指导教师： 张帆 2014年11月30日低磷胁迫下乙烯对小麦幼苗生理生化指标的影响摘要：关键词：小麦；磷胁迫；乙烯；磷含量引言：1材料与方法1.1材料培养及处理本实验所用材料为小麦种子，由周口种子公司提供。选取大小相近的种子，用95热水浸烫种子 5 s。将其放入培养篮中用蒸馏水培养，播种10天后，幼苗第一片真子叶完全展开时，将其转入Hoagland 营养液培养，每盆Hoagland 营养

2、液500ml，栽种植株20株。实验设置试验设高磷(Hoagland 营养液的含磷水平为2 mmol · L1Pi， HP)、 高磷 + 乙烯(HP + Eth)、 低磷(将 Hoagland营养液中磷水平降到 20 mol·L1 Pi， LP)、 低磷 +乙烯(LP + Eth)4 个处理， 完全培养液（NP）、完全培养液+乙烯（NP+Eth）、两组水培。5 次重复。低磷组中补加KCl 以补充因减少 KH 2 PO 4 的施入而引起的 K 亏缺。营养液中乙烯的浓度为 50mol·L 1。15 d后(幼苗第三片复叶完全展开)取样测定小麦各项生理指标。培养期间，3d更

3、换1 次营养液。每天通气 1 2 h， 自然光照。1.2 测定项目与指标1.2.1 形态学指标及生物量测定:分别在 4 个处理组中随机采取 10 个植株， 用直尺测量其主根长度、 最长侧根长度， 用排水法测定根系体积， 然后称量其地上部分与地下部分的鲜重和干重。再利用最长根长与根干重做比， 得出植株比根长。1.2.2光合速率及蒸腾速率:使用 CB- 1101 型光合蒸腾测定系统仪， 采用开路系统， 上午 10 00 11 00测定倒数第 3 片复叶的光合速率及蒸腾速率。每个处理重复 3 次1.2.3组织磷含量测定1.2.3.1实验原理测定磷含量的方法主要有磷钼蓝比色法(适宜含磷量较低)和钒钼黄

4、比色法(适宜含磷量较高)等。可直接用于植物组织可溶性磷的测定。如用于植物材料全磷含量测定，需将材料用浓H2SO4 H202消煮转化为可溶性磷。 1磷钼蓝比色法 在适宜的酸性条件下，磷酸能与钼酸铵作用形成磷钼酸按，并被抗坏血酸或氯化亚锡等还原剂还原，生成蓝色的磷钼蓝，并在650 nm处有最大吸收蜂，其颜色深浅与含磷量成正比，可直接比色测定。2钒钼黄比色法 待测液中的正磷酸与偏钒酸和钼酸能生成黄色的三元杂多酸，溶液黄色的深浅与磷酸含量成正比，生成物在440nm波长有吸收高峰。可用比色法定量磷。此法的优点是黄色稳定，对显色条件要求不十分严格，操作简便，干扰物少，灵敏度较低，工作范围随选用的吸收波长而

5、异。选用波长（nm） 400nm 440nm 470nm 490nm 测磷工作范围（mg/g） 0.75-5.5 2.0-15 4-7 7-201.2.3.2材料、设备及试剂 1材科 玉米、接骨木、瓜类、葡萄等幼苗；各种植物的根、茎、叶、种子及全株过60-80目筛干粉。 2设备 电子天平、分光光度计、恒温水浴锅、容量瓶、刻度试管、漏斗、小纸等。 3试剂 (1)2.5钼酸铵溶液 称取(NH4)2MoO4鸣25g用蒸馏水溶解并定容至1000ml。 (2)10mg/L磷标准液 精确称取烘至恒重的分析纯KH2PO4 0.4398g加蒸馏水溶解定容至1000m1，摇匀；取此液10ml定容至100ml即为

6、10mg/L磷标准液。(3)10抗坏血酸溶液（现用现配)。 (4)定磷试剂 按下列顺序及比例将各试剂混合即成。蒸馏水、6mol/L硫酸、2.5钼酸铵、10抗坏血酸按2:1:1:1(体积比)混合，贮于棕色瓶内。若变为棕黄色即不能使用。 (5)钒钼酸铵试剂A液：25g(NH4)6MO7O24·4H2O(钼酸铵)溶于400ml水。B液：1.25g偏钒酸铵溶于300ml沸水冷却后加入250ml浓HNO3将A液缓缓倾入B液中，搅匀定容1000m1，贮于棕色瓶中。(7)6mol/L Na0H 称24gNa0H溶于100ml水。(8)0.2二硝基酚指示剂 0.2g 2,6二硝基酚(或2,4二硝基酚

7、)溶于100ml水。(9)50mg/L磷标难液 称0.2197g经烘干的分析纯KH2PO4溶于400ml水加入25ml，3mol/LH2SO4定容1000m1，此液可久贮。1.2.3.3操作方法1.2.3.3.1磷钼蓝比色法(1)样品制备 取作物组织(叶、叶鞘或茎等)用组织捣碎机或研钵制成匀浆，定容，过滤(必要时可用活性炭脱色)，滤液备用。伤流液可直接测定。(2)标难曲线制作及样品测定 取6支试管，分别编号为o。5，按下表顺序加入磷标准液及其他试剂，以制作标准曲线。另取1支试管编号为6，作为样品管，按下表加人各试剂。并将各管充分摇匀，在45水浴中保温25min，以空白作对照，在分光光度计650

8、nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，磷含量为横坐标，绘制标准曲线。并根据6号管的吸光度值，从标准曲线上查出测定液中磷含量。表一 磷钼蓝比色法测磷反应体系项目管号0123456各管含磷量（µg）0246810x10mg/L磷标准液（ml）00.20.40.60.81.0样品0.2蒸馏水（ml）3.02.82.62.42.22.02.8定磷试剂（ml）3.03.03.03.03.03.03.0吸光度值（A650）1.2.3.3.2钒钼黄比色法(1)样品制备(参见磷钼蓝比色法)。(2)样品测定：吸待测液5-10ml于容量瓶，加2滴二硝基酚指示剂，加6mol/LNaaOH中和至刚呈黄色，加

9、10ml钒钼酸铵试剂，用蒸馏水定容，在440nm处比色，以空白溶液调零。(3)标准曲线制作：50ml容量瓶8个，编号07，准确吸50mg/L磷贮备标液0、1、2.5、5、7.5、10、15ml分别加入各瓶，按步骤(2)加入各试剂显色，即得：0、1.0、5、5.0、7.5、10、15磷的标准色阶，测定A440。以吸光度为纵坐标，磷标准浓度为横坐标，绘制工作曲线。1.2.3.4实验结果按计算公式计算样品中磷的百分含量。样品含磷量()mx×V/V1×W×10-4mx：标准曲线查出测定液中磷含量(µg)V：样品提取液总体积(ml)V1：用于测定的样品液(ml)

10、：w：样品鲜重或干重(g)10-4：样品含磷量(µg/g)换算成百分含量应乘系数 1.2.4叶绿素含量的测定（分光光度法）：将0.1克叶片剪碎，入25mL容量瓶，加95%乙醇25ml，加盖，于3040黑暗的温箱保温24h，至叶片变白，于663、645nm下比色（需注意比色前需添加95%乙醇至容量瓶刻度线）。用95%乙醇作为空白管调零。色素含量（mg·g-1）= 浓度（mg·L-1）×提取液总量（ml）/ 叶片重量（g）×1000叶绿素a的浓度 = 13.95 ´ OD665 6.88 ´ OD649 叶绿素b的浓度 = 24

11、.96 ´ OD649 7.32 ´ OD665 1.2.5根系活力的测定（TTC法）：称根尖0.5g，放入50mL烧杯中，加入0.4%TTC和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，浸没根，37下暗保温3h，后加1mol·L-1硫酸2ml，停止反应。（同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样，其他操作同上）。取出根，吸干水分后与乙酸乙酯34ml一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，在波长485nm下比色，以乙酸乙酯为空白调零。根系活力计算：四氮唑还原强度（mg·g-1根

12、鲜重h-1）C×V/1000/根重（g）×时间（h）其中C为根据所测样品提取液的吸光度值从标准曲线上所查处的样品提取液的浓度（mgTPF/L）；V为样品提取液的总体积（mL）；根系活力标准曲线 1.2.6硝酸还原酶活性测定磺胺比色法(李合生植物生理生化实验原理和技术M北京：高等教育出版社2000125-127)1.2.6.1原理：还原酶(nitrate reductase，NR)，是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(对-氨基苯磺酸胺)及-萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下： 红色偶氮

13、化合物生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以N g/(g.h)为单位。1.2.6.2材料、仪器设备及试剂1.2.6.2.1材料 ：植物器官(花瓣、叶片等)1.2.6.2.2仪器设备：冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL、100L)、移液管、精密电子天平、分光光度计、具塞试管、研钵、剪刀、镊子、恒温水浴、离心管、洗耳球1.2.6.2.3试剂： (1)亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯亚硝酸钠0.9857g溶于无离子水后定溶至1000mL，然后在吸取 5mL定溶至1000 mL，即为含亚硝态氮的1/mL的标准液

14、。(2)0.1mol/L的磷酸缓冲液(PH7.5)：Na2HPO4·12H2O (30.0905g)与NaH2PO4·2H2O (2.4965g)加无离子水后定溶至1000mL。(3) 1%磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100 mL 3mol/L HCl中(25mL浓盐酸加水定溶至100mL即为3mol/L HCl)，用蒸馏水稀释至100ml。(4)0.02%萘基乙烯胺溶液：0.200g萘基乙烯二胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。(5) 0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液(PH7.5)。(6)0.025m

15、ol/LPH8.7的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O和0.0570g NaH2PO4·2H2O定溶于1000mL无离子水中。(7)提取缓冲液：0.1211半光氨酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025mol/LPH8.7的磷酸缓冲液。(8)2mg/mL NADH溶液：2mg NADH溶于1mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液(PH7.5)。1.2.6.3试验步骤 (一)标准曲线的绘制 取7支洁净烘干的15mL刻度试管按下表顺序加入试剂，配成02.0g的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮

16、(g)为横坐标(x)，吸光度值为纵坐标(y)建立回归方程。试剂/mL管号1234567亚硝酸钠标准溶液00.20.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.81.61.20.80.40.01%磺胺44444440.02%萘基乙烯胺溶液4444444每管含亚硝态氮/g00.20.40.81.21.62.0(二)样品中硝酸还原酶活力测定(1)酶的提取 称取材料0.5g鲜样，剪碎于研体中置于低温冰箱冰冻30min，取出置于冰浴中加入少量石英砂及4mL提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在4、4000r/min下离心15min，上清液即为粗酶提取液。(2)酶的反应 取粗酶液0.4mL于10mL的试管中

17、，加入1.2mL 0.1mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.4mL NADH溶液，混匀，在25水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液(PH7.5)代替。(3)终止反应与比色反应保温结束后立即加入1mL磺胺溶液终止酶反应，再加入1mL萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝酸态氮(g)。1.2.6.4计算单位鲜重样品中硝酸还原酶活性=(x/V2)×V1/(W×t)式中：x为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，g；V1为提取酶时加

18、入的缓冲液体积，mL；V2为酶反应时加入的粗酶液体积，mL；W为样品鲜重，g；t为反应时间，h。1.2.7 MDA含量测定硫代巴比妥酸(TBA)法(龚富生，张嘉宝植物生理学实验M北京：气象出版社1995247-249)1.2.7.1原理在酸性和高温条件下，丙二醛和硫代巴比妥酸反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大吸收峰。但该反应受到可溶性糖和蛋白的极大干扰，可溶性糖和蛋白的吸收波长分别在450nm和600nm处。 植物组织器官的衰老总是伴随着细胞内膜的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来，研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)

19、产生的生物自由基(如O 2.-、OH.、1O2等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。膜脂过氧化作用产生的自由基，它不仅能够连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合。从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老或死亡。膜脂过氧化作用可能以下列进行： 丙二醛硫代巴比妥酸(TBA) 丙二醛 5,5-亚丙烯苯-双硫代巴比妥酸(双TBA)(三甲川)1.2.7.2材料、设备与试剂(一)材料 植物组织器官(叶片、花瓣等)(二)设备 分光光度计、水浴锅、研钵、精密电子天平、台式天平、试管、试管架、剪刀、量筒、烧杯、离心机、离心管（10mL）、微量加样

20、器（1000L）、移液管、镊子(三)试剂 (1)20%三氯乙酸(TCA三氯醋酸)；(2)2.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液：0.25g的硫代巴比妥酸粉剂加入到20%的三氯乙酸中定溶到100mL；(3)三氯乙酸(20%)：20g定溶到100mL为20%；1.2.7.3方法与步骤(1)分别取植株相应部位的材料0.2g，洗净擦干。(2)加1mL蒸馏水于研钵中充分研磨，并转移到试管中，再用4mL蒸馏水冲洗研钵(分两次)，仍转移至试管中。(3)向每个试管提取液中加5mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，充分摇匀。(4)置沸水浴中煮沸10min，立即取出放入冷水中冷却。(5)配平后，然后3000r/m离心15m

21、in，取上清液用分光光度计测其450nm、532nm、600nm处的吸光度(OD)值。 1.2.7.4计算MDA含量的计算公式：MDA(mmol.g-1FW)=6.452×(D532-D600)-0.599×D450×VT/(V1×W)1.2.8 POD(过氧化物酶)活力测定愈创木酚比色法1.2.8.1原理POD广泛分布在植物的各个组织器官中，在有过氧化氢存在下，POD能使愈创木酚氧化生成茶褐色物质，可用分光光度计定量测量生成物的OD，从而测定出POD的含量。1.2.8.2材料、仪器设备及试剂(一)材料 植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、低温高

22、速离心机、微量加样器 (1mL、100L)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子 (三)试剂(1)0.01mol/L PH7.0的磷酸缓冲液：61.0mL 0.1mol/L Na2HPO4与39.0mL 0.1mol/L NaH2PO4混合加蒸馏水至1000mL；(2)0.02mol/L的愈创木酚：取0.11mL愈创木酚加水至50mL；(3)0.04mol/L的过氧化氢：取80L 30%过氧化氢加水至20mL，是用前配制；1.2.8.3酶液的制备(1)取材料0.2g，加少许石英砂，再加1mL（分三次加）PH 7.0的PBS。(2)冰浴中充分研磨，4，120

23、00r/m 离心15min。(3)取上清液分装于Eppendoff管中，保存于-20的冰箱中备用。(4)取2个比色杯，按下表加入各种试剂。表 POD活力测定加样表反应物对照样品磷酸缓冲液/ mL3.02.9愈创木酚/ mL0.050.05酶液/ mL 00.1(5)加好反应物摇匀，在样品管中加10L 0.04mol·L-1过氧化氢溶液，即刻摇匀，在470nm处测OD值，读出第2分钟、第3分钟的OD值，按下面的公式计算酶活力单位1.2.8.4计算1.2.9脯氨酸含量测定磺基水杨酸浸提法(李合生植物生理生化实验原理和技术M北京：高等教育出版社2000258-260)1.2.9.1原理当用

24、磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。1.2.9.2材料、仪器设备及试剂(一)材料 植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、普通离心机、微量加样器 (1ml、20l、100l)、移液管、精密电子天平、分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、小烧杯、容量瓶、大试管、普通试管、注射器、水浴锅、漏斗、漏斗架、滤纸 (三)试剂(1) 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸

25、和20mL6mol/L磷酸中，搅拌加热(70)溶解，贮于冰箱中。(2)3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定溶至100mL。(3)冰醋酸(4)甲苯1.2.9.3试验步骤(一)标准曲线的绘制 (1)在精密电子天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250mL容量瓶中，加蒸馏水定溶，此标准液每毫升含脯氨酸100g。(2)系列脯氨酸浓度的配制：取6个50mL的容量瓶，分别乘入脯氨酸原液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL及3.0mL，用蒸馏水定溶至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1g/mL、2g/mL、3g/mL、4g/mL、5g/mL和6g/mL。(3)取6个试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，每管在沸水中加热30min。(4)冷却后各试管准确加入4mL甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为对照，于520nm波长处进行比色。(6)标准曲线的绘制：先求