光学显微镜的使用简单染色及革兰氏染色

1、光学显微镜的使用简单染色及革兰氏染色摘要显微镜的使用在我们学习微生物等课程中非常重要，历史上显微镜的发明和显微镜的每一次创新都给人类的认知带来了飞跃式的发展；给人类的生活带来了空前的拓展。在提倡科技创新的今天，显微镜的使用已经成为我们的一项基本技能。本次试验的主要目的是通过用油镜观察经过复染色的细菌玻片，分辨细菌的革兰氏阴阳性。 通过实验学习光学显微镜油镜的使用原理与方法、细菌的革兰氏染色法及分类鉴定的原理。为了研究细菌的形态，微生物学家发明了对细菌的染色，用两种以上的称复染，革兰氏发明了复染色法；先后用两种染色剂和媒染剂、脱色剂组合，由此而命名为革兰氏染色。革兰氏染色不仅可以观察细菌的形态，

2、同时将细菌分为两大类。一类是染色阳性菌是紫色，另一类染色阴性的是红色。由于细菌的结构上的差异，形成了不同的染色效果。了解染色性能有助于临床用药和细菌的鉴定。关键词显微镜的使用（Use of Microscope）革兰氏染色（Gram stain）复染（counterstain） 媒染（mordant dyeing）脱色（discoloration）一、实验目的1、 了解显微镜的构造及使用2、 学习显微镜（特别是白色圈标记的油镜）的使用方法3、 学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术4、 初步了解不同细菌的形态特征5、 了解革兰氏染色原理，并掌握其方法二、 实验原理（一）、普通显微镜的基本原理

3、1、基本原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。2、油镜微生物学使用的显微镜的物镜通常有低

4、倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔的不是一层空气（干燥系），而是一层油脂，称为“油浸系”。利用油镜的目的是增加显微镜的分辨力。（二）、简单染色的原理利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。用于染色的物质为一类苯环上连着发色基团或助色基团的有机化合物。发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使其形成盐。只有发色基团而无助色基团的苯化合物（色原）即使有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，难以与细胞结合而染色。常用的微生物染料都是盐，分碱

5、性染料（美蓝-亚甲蓝，结晶紫，碱性复红，沙黄-番红，孔雀绿)和酸性染料（酸性复红，伊红，刚果红）。通常采用碱性染料进行简单染色，因为微生物细胞在碱性，中性及弱酸性的环境中多带有负电荷，而染料电离后染色部分带正电性，易相互结合。当细胞处于酸性条件时（如分解糖类产酸）所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。 （三）、革兰氏染色的基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医师 Gram 创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细

6、菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色 的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的， 在染色过程中，当用乙醇处理时， 由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而 不易脱色。因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高。当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色。然后又被染上了复染液(番红

7、)的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basic dye)初染液；媒染剂(mordant)；脱色剂(decolorizing agent)和复染液 (counterstain)。碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。碘(iodine)是常用的媒染剂。 脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用 95%的酒精(ethanol)。复染

8、液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复 染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成 G+和 G-两大类群，常用的复染液是番红。革兰染色的意义：将细菌染成两大类，即革兰阳性菌和革兰阴性菌,可用于鉴别细菌；研究细菌的致病性，革兰阳性菌可产生外毒素，革兰阴性菌可产生内毒素；选择敏感的抗生素，革兰阳性菌可 使用青霉素等作用于细胞壁的抗生素，革兰阴性菌可使用红霉素、链霉素等抑制蛋白质合成的抗生素。 G+菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交

9、联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。三、实验器材1、 菌种：金黄色葡萄球菌（G+）、大肠杆菌（G-）、枯草芽孢杆菌以及自主选择菌种2、 溶液和试剂： 结晶紫、番红等各种染料以及碘液、酒精等 香柏油、二甲苯等3、 仪器及其它用品：普通光学显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿等四、实验内容（一）显微镜的构造及其使用1、显微镜的基本结构 实物图 结构图现代普通光学显微镜由机械系统和光学系统两大部分组成。机械系统主要包括：镜座、镜臂、载物台、转换器、调节装置等组成。光学系统主要包括：物镜、目镜、聚光器、光源等组成

10、。2、显微镜的使用方法安放右手握住镜臂，左手托住镜座，使镜体保持直立。桌面要清洁、平稳，要选择临窗或光线充足的地方。单筒的一般放在左侧，距离桌边34厘米处。低倍镜观察先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。聚光镜下的虹彩光圈应调到适当的大小，以控制射入光线的量，增加明暗差。高倍镜观察显微镜的设计一般是共焦点的。低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。有些简易的显微镜不是共焦点

11、，或者是由于物镜的更换而达不到共焦点，就要采取将高倍物镜下移，再向上调准焦点的方法。虹彩光圈要放大，使之能形成足够的光锥角度。稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。油浸镜观察油浸镜的工作距离很小，所以要防止载皮片和物镜上的透镜损坏。使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜，直接用油浸镜观察。显微镜有自动止降装置的，载玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。使用油浸镜时，

12、镜台要保持水平，防止油流动。油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。无论是油浸镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。注：使用显微镜进行观察时应用双眼五、实验步骤1、 简单染色流程图：洗片干燥涂片加热干燥固定染色液染色水洗干燥镜检 涂片取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴生理盐水，用接种环无菌操作将沾有菌苔的接种环置于载玻片上的生理盐水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；干燥自然干燥或用电吹风吹干；固定涂菌面朝上，通过火焰以固定菌物，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；通过火焰23次。染色将载玻片平

13、放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1、5min水洗（冲洗反面）倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；干燥用吸水纸吸去多余水分,自然干燥或电吹风吹干；镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察、记录；2、 革兰氏染色流程图：洗片干燥涂片加热干燥固定结晶紫初染水洗碘液媒染水洗乙醇脱色水洗番红复染水洗干燥镜检涂片： 先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 晾干：让涂片在空气中自然干燥。 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 染色：在固定过的涂片滴加草酸铵结晶紫液，染1.5min。 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色30s至流出液无紫色，立即水洗。 复染：滴加蕃红复染1.5min，水洗。六、实验结果及分析1、实验结果细菌名称菌体颜色细菌形