TP63基因多态性与肺癌易感性关系的研究

1、 本科毕业论文（设计）TP63基因多态性与肺癌易感性的研究学 院 广东药学院 专 业 预防医学 年 级 2009级 学生姓名 黄科明 学 号 0902501261 指导教师 刘丽 2013年 1 月 诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。 毕业论文（设计）作者（签名）： 年 月 日TP63基因多态性与肺癌易感性关系的研究【摘要】目的 探讨T

2、P63基因rs4488809位点单核苷酸多态性与肺癌易感性的关系。方法：对525例肺癌患者与1699例健康正常者采用病例对照研究。结果：(1) 2检验显示各种基因型在肺癌组和对照组中分布差异无统计学意义(2 =0.455，P=0.797)，两组人群等位基因频率差别无统计学意义（2 =0.271，P=0.60) (2)以TT基因型为参照，在调整性别、年龄和吸烟情况后，经logistic回归分析，发现CC基因型与肺癌发病无统计学关联(校正OR=0.90，95%CI 0.681.19，P=0.44)；携带CT基因型与携带CC基因型者联合分析，发现（CT+CC）基因型与肺癌发病也无统计学关联（校正OR

3、=0.98，95%CI 0.761.21，P=0.72）。(3)以突变基因型（CT+CC）而又不吸烟者为参照，在调整性别、年龄后，经logistic回归分析,(CC+CT)基因型并吸烟者OR=1.16(95%CI 0.891.50)，野生纯合基因型TT而不吸烟者OR=1.08(95%CI 0.781.51)，野生纯合基因型TT并吸烟者OR=1.13(95%CI 0.801.58)，均没有显著增加患肺癌的风险。结论：TP63 rs4488809基因位点多态性与肺癌易感性无相关性，且基因位点多态性与吸烟不存在交互作用。【关键词】TP63；基因多态性；肺癌易感性The study on the Po

4、lymorphism of TP63 Gene RS4488809and susceptibility to lung cancerAbstract Objective: To investigate the polymorphism of the TP63 gene rs4488809 and susceptibility to lung cancer. Methods: A case-control study was conducted included 525 lung cancer patients and 1699 control subjects. Results: (1) Th

5、e Chi-square tests showed there was no significant difference between the two groups(P>0.05).(2) For the TP63-rs4488809C/T polymorphism，individuals with CT and CC genotype were not correlated with lung cancer compared with T/T genotype after stratification analysis according to smoking.(3) After

6、stratification analysis according to smoking, it revealed that it was not associated significantly increased risk in smokers. Conclusion: TP63 gene rs4488809 polymorphism has no association with lung cancer.Keywords TP63；single nucleotide polymorphism；lung cancer susceptibility1 前言肺癌是中国最常见的恶性肿瘤，是病死率

7、最高的恶性肿瘤之一，患病率和发病率随着环境污染及吸烟率的上升在世界上大多数国家逐年上升1。根据全国肿瘤防治办公室的统计,肺癌已居我国男性恶性肿瘤发生率和死亡率的第一位,女性恶性肿瘤发生率的第二位和死亡率的第一位2。虽然科技的飞速发展极大地改变了医学的面貌,但肺癌的诊断和治疗依然不尽如人意,肺癌的发病率和死亡率较50年前增加了数十倍,且肺癌总的治愈率水平仍然低于15%。目前因为缺乏行之有效的肺癌筛查和早期诊断技术和方法,绝大多数患者就诊时已属晚期,失去了外科治疗的指征。因此提高肺癌治疗效果的关键在于注重肺癌的一级预防和早期诊断,筛查监测肺癌易感人群。肺癌的发生是一个多因素参与、多基因调控、多阶段

8、发生的复杂过程。研究表明影响肺癌的危险因素有吸烟、环境污染、职业、病毒感染、遗传背景、营养、微量元素缺乏等。其中吸烟、环境污染已被公认为是肺癌的最重要的危险因素。然而,肺癌患者80%90%与吸烟有关,但只有不到20%的吸烟者患肺癌3,因此,个体患肺癌并非单纯取决于吸烟或环境污染,主要取决于外在因素和基因,即基因与环境之间的相互作用，也就是说，肺癌在很大程度上还取决于个体的遗传易感性4。TP63是近年发现的TP53家族成员之一5，TP63基因位于染色体3q2q29区，包含15个外显子和2个启动子(启动子分别位于外显子1和内含子3)。TP63在细胞中存在有多种异构体，包括至少6种主要的TP63蛋白

9、的异构体。由于TP63具有2个不同启动子和多种内含子剪接方式，导致TP63基因编码产生不同亚型的TP63蛋白，故这些异构体可分成两大类：从外显子1开始转录的具有反式激活区的异构体称为TA异构体；从另一个位于外显子3和4之问的外显子3开始转录的没有反式激活区的异构体称为N异构体。N异构体由于3端剪切方式不同而产生3种不同C末端的异构体，因此再分、和亚型，其中异构体为全长的异构体，异构体为剪切掉外显子13的异构体，异构体为剪切掉外显子1114的异构体6。由上游启动子引发的转录，可产生具有转录激活区(TA)的全长TP63同源异构体TAp63、TAp63、TAp63,由下游启动子开始的转录则产生缺失转

10、录激活区的N端被截短的异构体Np63、Np63和Np63。较长TA异构体具有和TP53相似的功能，起着肿瘤抑制因子的作用，而较短N异构体因其缺少了氨基端的片断，从而丢失了抑制生长的转录激活功能，反而转变成为促进细胞生长及存活的转录因子7，8，9。细胞通过调节产生不同比例的异构体，在细胞生长和分化的过程中进行快速、准确的调节。这些异构群分子在生物的发育、发生学中起着重要的作用,在细胞中TP63的TA异构体能抑制细胞的无限增殖，而N异构体会促进细胞的生长、存活和迁移，并可以拮抗TP53蛋白和TA异构体的功能，解除其抑制细胞生长及促进细胞调亡的作用。通过同样的机制，N异构体会起到促进肿瘤细胞异常增殖

11、、存活和迁移作用10，11。本研究所探讨的SNP位于TP63基因的第l内含子，正是编码TAp63异构体的区域，所以它可能在TP63基因表达过程中发挥重要的调控作用。2材料与方法2.1研究对象 本研究包括肺癌患者525例和正常对照1669例。525例肺癌患者来自广药附属医院2009年到2013年1月间入院患者，其中男性360例（68.6%），女性165例（31.4%）。肺癌患者的纳入标准：经临床影像学和病理学检查确诊为肺癌，无性别、年龄、癌症家族史和临床分期的限制。排除标准包括曾经患有其他癌症疾病史以及未知的放、化疗病史者。1699例健康者则是与病例同时期募集于广东药学院附属医院的健康体检人群，

12、其中男性1380例（82.7%），女性289例（17.3%）。正常健康者的纳入标准：无传染病史、慢性病史、肿瘤病史等。2.2 资料的收集对病例和对照研究对象采用相同的调查表收集以下信息：包括性别、年龄等人口学特征，生活方式（是否吸烟等）、既往疾病史、肺癌家族疾病史等。吸烟情况按以下标准：每日吸烟量超过1支并且持续半年以上或者戒烟少于1年者定义为吸烟者；每天吸烟少于1支、且短于1年者定义为非吸烟者；戒烟超过1年者定义为曾经吸烟者。2.3 血样的采集在知情同意的情况下采集每位研究对象外周静脉抗凝血1ml。病例血样采集在接受肿瘤放化疗之前进行。抗凝血采集完毕后放入负20度冰箱保存。2.4 基因组DN

13、A提取2.4.1试剂：天根试剂盒(CL，FG，PK，TB)，异丙醇，70乙醇(现配)2.4.2仪器：Eppendorf Centrifuge 5415 D 常温离心机国华HH-42快速恒温数显水箱Eppendorf移液器(1ml、 100ul、 10 ul)及相应枪头NANO DROP 1000 Spectrophotmeter微量紫外分光光度计Eppendorf Concentrator 5301 快速反应浓缩仪吸水纸EP管(2.0ml、1.5ml)废液缸手套记号笔2.4.3实验步骤血样采用天根试剂盒(DP319-02)进行抽提，该试剂盒抽提DNA原理为溶液盐析法，试剂盒内包括细胞裂解液CL

14、 2×250ml；缓冲液FG 120ml；蛋白酶K 1ml；缓冲液TB 60ml，基本操作步骤如下：图1 盐析法提取DNA流程图(1) 将保存于-20。冰箱中的抗凝血取出，37。C水浴融解(2) 细胞裂解：1ml抗凝血加入1ml细胞裂解液，颠倒混匀100次后12000rpm/ref离心2分钟，弃上清；再加入1.5ml细胞裂解液，快速颠倒混匀至无明显细胞团块后12000rpm/ref离心2分钟，弃上清；(3) 蛋白酶消化：配制缓冲液FG和蛋白酶K混合液(两者比例为100:1;见表1)；加入500mlFG和蛋白酶K混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块；65°C水浴25分钟，期间颠倒

15、混匀数次；(4) 异丙醇沉淀(操作轻柔)：加入500ml异丙醇，缓慢颠倒混匀至出现丝状基因组DNA；12000rpm/ref离心5分钟，弃上清；(5) 12000rpm/ref离心2分钟，弃上清。再次加入500ul 70乙醇，颠倒50次，离心 12000×2min。倒弃上清，将离心管倒置在干净吸水纸上停留至少5分钟。(6) DNA溶解：空气干燥DNA沉淀至所有液体挥发干净；加入200ul缓冲液TB，确保DNA漂浮于TB内。然后55°C水浴溶解DNA4小时后置于4°C冰箱过夜以继续溶解；表1 不同体积血样所需各种缓冲液用量(l)缓冲液血液体积(l)100300100

16、0300050001000020000细胞裂解液 CL25075025007500125002500050000缓冲液 FG5015050015002500500010000蛋白酶 K0.51.55152550100100%异丙醇501505001500250050001000070%乙醇5015050015002500500010000缓冲液TB10020020030050010001000FG和蛋白酶K混合液1030100300500100010002.5 SNP分型2.5.1 试剂TaqMan® Universal PCR Master Mix (2X)双蒸水HEXFAMTaq

17、Man 引物TaqMan 探针TaqMan SNP Genotyping Assays2.5.2仪器NanoDrop 2000Eppendorf冷冻台式离心机低速离心ABI 7900HTEppendorf移液器(1ml、 100ul、 10 ul)及相应枪头384孔板2.5.3 TaqMan探针技术基本原理TaqMan探针法，也称为荧光定量PCR，是一种高度特异的定量PCR技术，其基本原理是利用Taq酶的53外切核酸酶活性，切断探针，以产生荧光信号。因为探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只

18、能与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR反应的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其35外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图2）。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。图2 TaqMan基因分型原理图。2.5.4 TaqM

19、an基因分型步骤(1)准备样本：TaqMan基因分型DNA样本的浓度要求为520ng/l，DNA提取完成 后使用紫外可见分光光度计(NanoDrop 2000)检测DNA浓度，将DNA浓度稀释至 520520ng/l。TaqMan基因分型引物和探针由上海基康公司合成(2)配置实验体系：按照下表要求的实验体系将引物和探针稀释。将引物和探针 混合，配成10X Assay Mix，在混合的Assay Mix中加入双蒸水，然后加入Taq- Man® Universal PCR Master Mix (2X)，混匀。(表2)表2 实验体系加样表试剂体积（ul） 双蒸水 0.8 TaqMan&#

20、174; Universal PCR Master Mix（2X） 2.5 前向引物 TaqMan® 10X Assay Mix 0.225 后向引物 0.225 FAM 0.125 HEX 0.125 DNA模板 1.0 双蒸水 0.8 总计 5.0(3)加样：将混匀混合液分别加入到已经标记区域的384孔板中。加入稀释好的 DNA模板。(4)离心：使用Eppendorf冷冻台式离心机低速离心，使样本置于384孔的底部。 贴膜，用压膜板将膜压平。(5)上样：本实验采用ABI 7900HT进行TaqMan基因分型，开机进行设置和热循环，如表3所示：表3 PCR循环设置步骤温度（）时间（

21、分钟） 1 50 2:00 2 95 10:00 45个循环 3 93 0:30 4 62 1:00 5 4 (6)数据读取：机器运行完毕后，取样下机进行分型数据读取，基因分型数据采用SDS2.3读取数据。2.6 统计学分析应用SPSS 21.0软件包对检测结果进行统计学分析。(1)研究对象的基本人口学特征：采用双侧2检验比较性别、年龄、吸烟状况、基因型及等位基因在肺癌组、对照组的频率分布等。(2)Hardy-Weinberg平衡检验(HWE)：采用2检验来分析对照组中SNP基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。 (3)SNP位点分析：采用非条件logistic回归分析基因多态性

22、与肺癌易感性间的关系，以比值比OR和95%Cl可信区间表示相对危险度，计算OR值及95%CI时，以性别、年龄、吸烟状态作为协变量进行统计学校正。(4)分层分析：肺癌的发生是由基因和环境因素共同作用的结果，在其发展过程中存在着基因-环境之间的交互作用。特别是吸烟这个环境因素，对于肺癌的发生尤其重要。因此，我们通过分层分析，使用传统的logistic回归模型来探索基因-环境的交互作用与肺癌的关联。3结果3.1 肺癌组与对照组的一般情况比较 本实验入选对象共2194人，见表4，肺癌组(23.9%)与对照组(76.1%)在年龄、性别方面分布频率差异具有统计学意义（P<0.05），在吸烟情况方面的

23、分布频率无统计学差异。经检验，正常对照人群位点的基因频率符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明该样本具有一定的代表性。表4 肺癌组与对照组一般情况的比较（n%）项目 肺癌组(n=525) 对照组(n=1669) P*年龄（岁）<6060性别男女吸烟情况有吸烟史无吸烟史241(45.90)284(54.10)360(68.57)165(31.43)240(45.71)285(54.29)602(36.07)1067(63.93)1380(82.68)289(17.32)846(50.69)823(49.31) <0.05 <0.05 0.047 * P值采用双侧卡方检验

24、。3.2 SNP位点基因型及等位基因与肺癌的关联性分析在TP63基因rs4488809位点上，肺癌组中24.38%为TT,49.90%为CT，25.72%为CC；对照组中TT、CT和CC的基因型频率分别为24.03%、48.77%、27.20%，见表5。2检验显示各种基因型在肺癌组和对照组中分布差异无统计学意义(2=0.455，P=0.797)；而等位基因T在病例组与对照的频率分别为49.33%和48.41%，等位基因C则分别为50.67%和51.59%，两组人群等位基因频率差别无统计学意义（2=0.271，P=0.60)。表5 基因型与等位基因在肺癌组与对照组中的频率分布基因型及等位基因肺癌

25、组n(%)对照组n(%)2 P*基因型TTCTCC等位基因TC128(24.38)262(49.90)135(25.72)518(49.33)532(50.67)401(24.03)814(48.77)454(27.20)1616(48.41)1722(51.59)0.455 0.797 0.271 0.602* P值采用双侧卡方检验。3.3 TP63基因rs4488809多态性与肺癌易感性的关系TP63基因rs4488809多态性与肺癌易感性的关系如表6所示，以TT基因型为参照，在调整性别、年龄和吸烟情况后，经logistic回归分析，发现CC基因型与肺癌发病无统计学关联(校正OR=0.90

26、，95%CI 0.681.19，P=0.44)；携带CT基因型与携带CC基因型者联合分析，发现（CT+CC）基因型与肺癌发病也无统计学关联（校正OR=0.98，95%CI 0.761.21，P=0.72）。表6 TP63基因rs4488809多态性与肺癌易感性的关系基因型肺癌组n(%)对照组n(%)校正的OR* P*（95%CI）TTCTCCCT+CC128(24.38)262(49.90)135(25.72)397(75.62)401(24.03)814(48.77)454(27.20)1268(75.97)1.00(参照) 0.99(0.781.27) 0.970.90(0.681.19)

27、 0.440.96(0.761.21) 0.72 *风险度计算采用logistic回归模型，OR值经过性别、年龄和吸烟情况校正； 代表无此项。3.4 TP63基因多态性和吸烟对肺癌危险的交互作用分析 应用分层的logistic回归模型，分析TP63 rs4488809位点基因多态性与吸烟的作用，如表7所示。TP63基因rs4488809多态性与肺癌易感性关系分析的结果提示，等位基因C可能是保护效应。故在调整性别、年龄后，以携带（CT+CC）基因型而又不吸烟者为参照，（CT+CC）基因型并吸烟者OR=1.16(95%CI 0.891.50)，野生纯合基因型TT而又不吸烟者OR=1.08(95%C

28、I 0.781.51)，野生纯合基因型TT并吸烟者OR=1.13(95%CI 0.801.58)，均没有显著增加患肺癌的风险，故认为TP63基因rs4488809位点与吸烟不存在交互作用。表7 TP63基因多态性与吸烟的交互作用对肺癌患病风险的影响基因型非吸烟者 有吸烟史 病例/对照 OR*（95%CI） P*病例/对照 OR*（95%CI） P*CT+CCTT 221/64764/176 1.00（参照）1.08(0.781.51) 0.63176/62164/2251.16(0.891.50)1.13(0.801.58) 0.27 0.50* 风险度计算采用logistic回归模型，以突变

29、基因型（CC+CT）且不吸烟者作为参照；OR值经性别、年龄校正； 代表无此项。 4 讨论与结论4.1 讨论肺癌是目前中国最常见的恶性肿瘤之一，而且其发病率有逐年增加的趋势，严重影响人类的健康，然而其发病机制尚未完全阐明。目前较一致的观点认为，肺癌的发生是环境危险因素和个体遗传因素共同作用的结果。基因多态性是决定疾病易感性、表型和治疗反应性差异的重要因素，在肺癌的发生、发展中起重要作用。本文通过病例对照研究，对TP63基因单核苷酸多态性与肺癌易感性的关系进行探讨。 TP63作为TP53家族成员之一5，具有与TP53同源的DNA结合域。TP53肿瘤抑制基因在调控细胞周期和维持基因组稳定性方面具有至

30、关重要的作用12,13，其与多种肿瘤的发生发展密切相关，主要涉及到细胞周期、阻滞、凋亡、遗传质完整性的保持、血管生成和细胞衰老的抑制14。同时TP53还可以和一些细胞内控制程序性死亡的蛋白结合,从而使该基因在肿瘤发生中起到抑制作用1520。而TP63是在细胞发生DNA损伤后诱导产生的21，DNA损伤的积聚及机体遗传毒性应激反应的缺乏会导致肿瘤的发生。TP63在肿瘤发生中的作用目前仍不十分清楚，TP63的功能存在着比TP53更广泛的多样性。在某些类型的细胞中，TP63会像TP53那样发挥抑制肿瘤生长的作用；而在另一些情况下，TP63却会产生促进肿瘤生长的作用22,23。也有研究证明，TP63基因

31、位点在多种肿瘤中扩增而不是缺失，提示TP63在肿瘤发生中更多的是致癌而不是抑癌作用24。 本研究发现，与携带TT基因型相比，TP63基因rs4488809位点中的等位基因C与肺癌发病无统计学关联（校正OR=0.98，95%CI 0.76-1.21，P=0.72），同时TP63基因rs4488809位点与吸烟之间并不存在交互作用（P>0.05）。但最近的一项在日本和韩国人群中进行的GWAS研究则显示TP63基因区域中的rs4488809多态性与肺腺癌发生密切相关，提示TP63基因单核苷酸多态性可能是影响东亚人群肺腺癌发生的遗传易感因素25。两个实验结果不一致的原因，可能是选择不同肺癌细胞病

32、理类型以及研究人群的种族不同造成的。同时，由于本次研究中对照组并没有按照年龄、性别与病例组频数匹配，造成实验结果有一定的局限性。因此关于TP63基因多态性与肺癌易感性的关系，还有待于进一步研究，如扩大样本量，对不同种族人群、不同肺癌细胞病理类型进行分层研究，并结合功能研究来验证TP63基因对肺癌的作用等。4.2 结论本实验中采用病例对照研究方法分析TP63基因的rs4488809多态性与肺癌易感性之间的关系，结果表明TP63 rs4488809多态性与肺癌遗传易感性无关。参考文献1 Kurzepa-Hasan E, Hansan K, Adamek R. Tobacco smoking amo

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