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1、Dnmtl DNA 甲基转移酶 1(DNA methyltransferase 1)DNA甲基转移酶的表达调控及主要生物学功能 来源：易生物实验浏览次数：2508网友评论0条DNA甲基化是表观遗传学的重要部分，同组蛋白修饰相互作用，通过改变染色质结构，调 控基因表达。在哺乳类细胞或人体细胞中，DNA甲基化与细胞的增殖、衰老、癌变等生命现象有着重大关系。对催化 DNA甲基化的DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, Dnmt)的研究 可以揭示DNA甲基化对基因表达调控的机制，从而研究与之相关的重要生命活动。文章以 DNA甲基转移酶作为切入点，探讨DNA甲基转移酶在基因表达调

2、控中发挥的作用及其主要生物学功能。关键词：甲基生物学调控 DNA甲基转移酶表观遗传学 DNA甲基化表达调控生物学功能甲基 转移酶苏玉，王溪，朱卫国北京大学基础医学院，北京100191摘要：DNA甲基化是表观遗传学的重要部分，同组蛋白修饰相互作用，通过改变染色质结 构，调控基因表达。在哺乳类细胞或人体细胞中，DNA甲基化与细胞的增殖、衰老、癌变等生命现象有着重大关系。对催化 DNA甲基化的DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, Dnmt)的研究 可以揭示DNA甲基化对基因表达调控的机制，从而研究与之相关的重要生命活动。文章以 DNA甲基转移酶作为切入点，探讨DNA甲基转移

3、酶在基因表达调控中发挥的作用及其主要生物学功能。关键词：DNA甲基转移酶；DNA甲基化；表观遗传学DNA methyltransferases: the role in regulation of gene expression and biological processes SU Yu, WANG Xi, ZHU Wei-GuoSchool of Basic Medical Sciences, Peking University, Beijing 100191, ChinaAbstract: Both hitone modification and DNA methylation remo

4、dulate chromatin structure and control gene expression or silence. As a main enzyme for DNA methylation, DNA methyltransferase (Dnmt) is not only associated with DNA methylation, but also links to many important biological activities, including cell proliferation, senescence and cancer development.

5、This review focuses on structure, regulation and function in biological processes of Dnmt.Keywords: DNA methyltransferase; DNA methylation; epigeneticsDNA的甲基化修饰是真核细胞基因表达调控的特点之一。在哺乳动物的某些基因中，5'侧翼区为CpG的高频区，称为CpG岛。DNA甲基化多发生在这些 CpG岛的胞嚅嚏第五位碳(C5) 上。首先甲基转移酶与 DNA结合，将目标核昔酸反转暴露于DNA双螺旋之外，之后半胱氨酸的亲和基团与胞嚅嚏第六位碳

6、(C6)共价结合，从S泉昔甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,Adomet)处转甲基至胞嚅嚏 C5上1。通过这种甲基化机制和组蛋白修饰、染色质重组等 共同作用，细胞可以不改变DNA的碱基序列，而调控不同基因在不同细胞和组织中的表达。DNA的甲基化是通过 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, Dnmt)催化和维持的。一 般认为，哺乳动物的Dnmt有4种，分为两个家族：Dnmt1和Dnmt3 (另有一种 Dnmt2 ,主要为tRNA的甲基转移酶，也有报导称 Dnmt2具有微弱的DNA甲基转移酶活性2)(图1 )。 Dnmtl家族在DNA复制和修复中维持其甲

7、基化；而 Dnmt3家族则催化 CpG从头甲 基化(denovo methylation )。Dnmt3 包括了两个从头甲基转移酶 Dnmt3a、Dnmt3b和一个 调节蛋白 Dnmt3L1。图1 Dnmt的家族成员及其结构Dnmt1的结构域为：N端与某些蛋白特异结合区，C端的酶活性区和及其他未知区域；Dnmt2主要为tRNA甲基转移酶； Dnmt3a和Dnmt3b 的结构域为：N 端的可变区，PWWP结构域，半胱氨酸富集区，C端的酶活性区；Dnmt3L有半胱氨酸富集区，但C端不具单独的催化活性1。罗马数字表示酶结构中的一些保守序列。Dnmt1是1988年Bestor等3从真核生物克隆出来的第

8、一个DNA甲基转移酶，是一种胞嚅嚏C5特异的甲基转移酶。Dnmt1分子量为183 kDa, 一般认为Dnmt1有3个结构域：C端 的催化域，N端的某些蛋白识别的靶区域，以及其他未知区域4。最近有研究表明 Dnmt1的半胱氨酸富集区可与未甲基化的CpG岛结合，这说明除了催化区域以外，Dnmt1的其他结构域也与酶活性有重要关系5。 Dnmt1的结构可能还会通过与氨基酸相互作用和(或)催化域的丝氨酸磷酸化而发生变化6, 7,这可能与酶的活性、与 DNA结合等的调节有关。Dnmt1的主要作用是维持 DNA甲基化，这种维持作用可以将DNA甲基化信息传递给子代细胞。Dnmt3a和Dnmt3b的结构域基本相

9、同，都在 N端存在一可变区，可变区之后至 C端依次 为：PWWP (Proline tryptophan tryptophanproline )结构域，其可能与 DNA非特异性结合有 关；半胱氨酸富集的锌结合区域；C端的催化活性区域。Dnmt3L是一种Dnmt3类似蛋白，具有半胱氨酸富集的锌结合区域，但缺少 C端的酶催化 活性域，所以没有单独的催化活性。但它是DNA从头甲基化的调节因子，通过与Dnmt3a和 Dnmt3b的C端结合，可提高它们的催化活性，正向调节DNA从头甲基化8。1 DNA甲基转移酶的基因表达调控 一般认为DNA甲基化通过两种途径抑制基因表达。第一种是直接阻碍转录因子与甲基化

10、的CpG岛结合，直接抑制基因表达9;另一种是通过招募 DNA甲基结合蛋白 (Methyl-CpG-binding proteins, MBP )及一些阻碍复合物，阻止转录因子与特定 DNA序列结 合，间接抑制基因表达10。本实验室发现 p21启动子上的转录因子Sp1结合位点的甲基化并不阻碍Sp1结合到其启动子上11,说明第一种途径的抑制作用并不表现在所有基因中。而在第二种途径中，Dnmt和MBP可与组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDAC)、共抑制子(co-repressor)和ATP依赖的染色质重塑蛋白等结合形成抑制复合物，与组蛋白去 乙酰化和染色体重塑共同作用，

11、从而抑制基因表达1214。Dnmt与组蛋白修饰相关因子的相互作用是Dnmt调控基因表达的重要手段。Dnmt1的N末端可以与 HDAC1、HDAC2结合，Dnmt3a和Dnmt3b也可以招募 HDAC,从而使组蛋白去乙 酰化15。Dnmt除了可以与HDAC相互作用外，还与组蛋白的甲基化有关。DNMT1的N端可以招募组蛋白甲基化酶Suv39h1 (Suppressor of variegation 3-9 homolog 1)和识别 HP1(Heterochromatin protein 1) 14。Dnmt3a 也可与 HP1 相互作用，而 HP1 具有识别甲基 化的组蛋白、稳定异染色质浓缩结构

12、的作用16。研究人员还发现DNMT3A可以直接识别对称甲基化的组蛋白 H4R3me2s (Symmetric methylation of histone H4 arginine 3 ) 17。这 说明Dnmt的基因表达抑制作用与组蛋白修饰和染色质重塑相关。这种机制的意义可能是： 由于组蛋白的变构在细胞增殖过程中不能直接传递，所以通过Dnmt对新复制得到的子代DNA甲基化型的保留，得到基因是否转录的信息，从而使子代细胞中组蛋白正确地乙酰化 或去乙酰化。DNMT1 的 N 端可以识别 MBP 家族中的 MBD1 (Methyl-CpG binding domain 1)、MBD3、 MeCP2(

13、 Methyl-CpG binding protein 2 ) 14。一项研究显示，大鼠肝细胞瘤中的 Dnmtl、Dnmt3a 和Dnmt3b数量是正常肝细胞的 410倍，MeCP2是正常的8倍，MeCP2与MT-1启动 子相互作用，抑制MT-1 (一种抗氧化剂)的表达，说明MeCP2和Dnmt都与肿瘤中MT-1基 因表达抑制有关18。在Xist基因沉默的相关研究中，另一种甲基结合蛋白 Mbd2与Dnmt1和HDAC抑制物有相互作用，是导致Xist基因沉默的中介19。Dnmt通过招募这些蛋白，与组蛋白修饰和染色体重塑共同作用，间接抑制基因表达。Dnmt间接的基因沉默作用还表现在与一些共抑制子的

14、相互作用上。如 Dnmt3a可以与一种 转录抑制蛋白 RP58结合，二者共同抑制基因表达20。DNMT3B在HeLa细胞中可以与共抑制子 SIN3A ( Kinetochore associated protein )相互作用，同时也可与KIF4A (Kinesin familymember 4A)和condensin相互作用参与染色体浓缩 21。这些研究结果表明，Dnmt与相关蛋白的相互作用不仅是间接抑制基因表达的途径，也是Dnmt参与组蛋白修饰、染色体变构的途径。最近的一些研究还揭示了Dnmt与另一组基因沉默相关因子PcG (Polycomb group)的相互作用。PcG蛋白组成的多聚复

15、合物PRC( Polycomb repressive complexes) 2和3中的 EZH2(Enhancer of zeste homolog 2 )可以和 Dnmt相互作用，共同抑制基因表达，并且 EZH2是 其靶基因启动子甲基化所必需的22。PRC1活化相关的 NSPc1( Nervous system polycomb 1 )蛋白，与 DNMT1、EZH2共同结合在 HeLa细胞中的 HOXA7启动子上，当 NSPc1缺失时 DNMT1与HOXA7启动子的结合下降，同时 DNMT1缺少时NSPc 1的结合水平也下降23。 这些研究结果说明Dnmt参与的DNA甲基化的基因沉默机制和P

16、cG参与的基因沉默机制也存在交互作用。一些因子可以作用于Dnmt,导致酶的数量或活性发生改变，从而影响DNA甲基化水平，影响基因表达。HDAC抑制剂apicidin在HeLa细胞系中可以下调 DNMT1水平，而DNMT1的 缺少会导致肿瘤细胞死亡 24。SNF2 (Sucrose non fermenting protein 2 )家族相关的 ATP依 赖染色质重塑蛋白hSNF2H ( Human sucrose non fermenting protein 2 homologue)可以与DNMT1的N端结合，当hSNF2H存在时，DNMT1对单核昔酸的亲和力升高 25。研究发 现另一种SNF

17、2家族相关的 ATP依赖染色质重塑蛋白 LSH (Lymphoid-specific helicase)并不 直接导致DNA甲基化，而是通过增加 Dnmt的数量间接引起甲基化26。最近的一项研究中， 小鼠 LSD1 ( Lysine-specific demethylase 1,又称为 KDM1 和 AOF2)的编码基因 Aof2 被敲除 后DNA甲基化水平下降，Dnmt1水平下降27。组蛋白甲基化酶 SET7也可调控的 DNMT1 的稳定性。SET7通过直接与 DNMT1相互作用，并特异地甲基化DNMT1的第142位赖氨酸，实现其对Dnmt1数量和活性的抑制作用28。可见，这些因子可以通过调

18、控Dnmt数量和活性间接参与基因沉默，同时 Dnmt也通过这些因子参与其他水平的基因表达调控作用。 除了改变Dnmt的数量或活性，调控 Dnmt与基因启动子的结合也是调控DNA甲基化水平的方式。本实验室研究发现HDAC抑制剂depsipeptide在肺癌细胞系 H719和H23、大肠癌细胞系HT-29和胰腺癌细胞系 PANC1中对p16、SALL3 GATA4基因有激活基因沉默的作用。 Depsipeptide通过降低H3K9的甲基化，减少 DNMT1与上述基因启动子的结合，最终导致 基因沉默29。这些结果进一步说明Dnmt对基因沉默的影响是与组蛋白结构变化相关的，二者间存在密切的交互作用。

19、总之，Dnmt的基因表达调控机制是复杂的、多水平的。Dnmt参与了 DNA甲基化、组蛋白修饰和染色体重塑，组成了复杂的表观遗传调控网络，共同调控基因表达。2 DNA甲基转移酶的主要生物学功能Dnmt介于上述 Dnmt的表达调控机制，Dnmt在多种生命现象中发挥了重要作用。下面就 的重要生物学功能进行探讨。2.1 DNA甲基转移酶与肿瘤在肿瘤细胞中，抑癌基因的不正常甲基化抑制了抑癌基因的表达，使细胞周期失控，发生癌变。很多研究都证明了DNA甲基化异常与肿瘤发生有关。研究者们在乳腺癌、大肠癌、胃癌中发现了某些基因的高甲基化3032。很多癌变组织中 Dnmt的表达也是增加的33, 34。Dnmt的增

20、加往往发生在 DNA甲基化之前，可能是引起DNA甲基化异常的原因。Dnmt的两个家族成员在以上机制中的作用是协同存在的。例如：下调DNMT3B在直肠癌细胞中的表达只能使整体甲基化水平下降3%,下调两者却可使甲基化水平下降95%35。研究发现缺乏DNMT1表达的肿瘤细胞仍伴有明显的基因组甲基化和相关基因沉默35。这说明Dnmt家族之间在调控肿瘤发生过程中不仅仅是互补关系，而可能是相互协同甚至相互促进的关系。 根据以上结论和推断，研究人员提出了以Dnmt为靶点治疗肿瘤的新思路。5-氮杂-2'-脱氧胞昔(5-aza-2' -deoxycitydine, 5-Aza-CdR, Deci

21、tabine)作为一种 Dnmt 抑制剂，被证明有 抑制肿瘤细胞的作用36, 37。它可以和结合在基因启动子上的Dnmt结合，抑制其对启动子的甲基化38, 39。5-Aza-CdR在患有白血病、骨髓增生异常综合征 (Myelodysplastic syndrome, MDS)、非小细胞性肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC的病人中进行了1期、2期临床试验，显示了一定的抗肿瘤作用40。但5-Aza-CdR存在的一些问题限制了其临床应用，如其体内半衰期短、易被胞嚅嚏核昔脱氨酶失活、会引起粒细胞减少的毒副作用等 41,42。这些问题也使其实体瘤的治疗效果受到限制。

22、本实验室研究发现5-Aza-CdR可以通过增加p21的表达抑制细胞增殖，而这条通路是p53依赖的36。这项研究对5-Aza-CdR的临床应用具有参考价值，因为很多实体瘤细胞中p53广泛突变，而像白血病等癌症中 p53突变少，5-Aza-CdR更能发挥其抗肿瘤作用。2.2 DNA甲基转移酶与发育DNA甲基转移酶在胚胎发育中起到了关键作用。Dnmt3a、Dnmt3b在ES细胞中表达丰度较高，成体组织中很低，ES细胞中的Dnmt3a和Dnmt3b失活会干扰 DNA从头甲基化，Dnmt3b、Dnmt3a基因突变的小鼠胚胎畸形和死亡率极高43。在胚胎发育的早期，Dnmt3a和Dnmt3b功能重叠。Dnm

23、t1的甲基化作用发生在植入期，并在胚胎发育过程中起到了维 持甲基化的作用43。这说明，无论是DNA从头甲基化还是 DNA甲基化的维持都是胚胎发 育的重要环节，可能与不同组织细胞中不同基因的表达有关。另外，DNA甲基转移酶与胚胎早期植入子宫内膜也有一定联系。有研究显示DNMT1、DNMT3A、DNMT3B可以联合作用，调节E钙粘素(E-cadherin)的表达，从而调节子宫内膜对胚胎的接受能力44。这也说明Dnmt在胚胎发育中起到的重要作用，异常的胚胎植入和流产很有可能与Dnmt的异常有关。 在神经系统的发育中，记忆的形成与DNA甲基化的动态变化有关。一项针对大鼠海马区域的记忆形成的研究显示，

24、与记忆形成相关的基因的甲基化水平在条件反射形成前后发生变化， Dnmt的mRNA水平也有所改变。当使用 Dnmt抑制剂后，已经甲基化的基因去甲基化，条 件反射过程会减弱或消失45。这说明与记忆形成有关的DNA甲基化并非长期的、稳定的，而是动态变化的，记忆形成与表观遗传学现象有密切关系。2.3 DNA甲基转移酶与细胞衰老DNA的甲基化是DNA亚序列水平的一种遗传信息，可以传递给子代细胞。这种传递主要通 过Dnmt1维持。然而衰老的细胞会出现“ DNA甲基化漂移”。研究者们发现在很多衰老的 组织和细胞中广泛存在 DNA甲基化程度降低的现象46。这种DNA甲基化漂移会导致 DNA 低甲基化或过甲基化。产生这两种现象的内源性机理与DNA甲基转移酶的不正常表达有关47。在