蛋白质的化学修饰ppt课件

1、1 蛋白质性质鉴定蛋白质性质鉴定 蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术, ,是确定蛋白质产品的是与非的是确定蛋白质产品的是与非的问题问题, ,尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它的尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白质研鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚

2、，工作起来将会困难重重。因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。究技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。2;.蛋白质鉴定的主要参数蛋白质鉴定的主要参数 蛋白质分子是非常复杂的生物大分子蛋白质分子是非常复杂的生物大分子, ,能代表其特征参数很多能代表其特征参数很多. .但在普通实验室能够但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下几种。进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下几种。(1)(1)蛋白质的质量鉴定蛋白质的质量鉴定( (分子量分子量) )(2)(2)蛋白质带电性鉴定（等电点）蛋白质带电性鉴定（等电点）(3)(3)蛋白质结构鉴定蛋白质结构鉴

3、定( (一、二级结构、晶体、肽谱、一、二级结构、晶体、肽谱、NC-NC-末端末端) )(4)(4)蛋白质生物学功能鉴定蛋白质生物学功能鉴定( (生物活性、比活、酶促动力学生物活性、比活、酶促动力学) )( (5)5)免疫学鉴定（抗原免疫学鉴定（抗原- -抗体反应、酶联免疫反应）抗体反应、酶联免疫反应） 3;.4;.5;.6;.78910111213 组成组成 该电泳系统由该电泳系统由两层不连续聚丙烯酰胺凝胶两层不连续聚丙烯酰胺凝胶组成组成上层胶上层胶: :浓缩胶浓缩胶(stacking or concentration gel)(stacking or concentration gel) 浓

4、浓 度度 2-5%2-5%，缓冲液，缓冲液pHpH值为值为6.86.8 下层胶：分离胶下层胶：分离胶(seperation or resolving gel)(seperation or resolving gel) 浓浓 度度 5-20%5-20%，缓冲液，缓冲液pHpH值为值为8.38.31415 特点特点 具有很高的分辨力，这是因为它具有以下三种效应：具有很高的分辨力，这是因为它具有以下三种效应： 样品浓缩效应样品浓缩效应 A. A. 分离胶的阻力（孔径小），分离胶的阻力（孔径小），浓缩作用浓缩作用 B. B. 缓冲液离子成分的不同缓冲液离子成分的不同 （甘氨酸离子（甘氨酸离子 （慢）氯

5、离子（快）（慢）氯离子（快） ，压缩作用压缩作用 C .C .浓缩胶与分离胶之间浓缩胶与分离胶之间pHpH值差值差（分离胶（分离胶pHpH高，高， 调节慢离子的迁移率）调节慢离子的迁移率） 16 分子筛效应分子筛效应 大分子运动慢，小分子运动快大分子运动慢，小分子运动快 电荷效应电荷效应 带电荷多的运动快，带电荷少的运动慢带电荷多的运动快，带电荷少的运动慢17181930%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺丙烯酰胺29.2 g， 甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺0.8 g， 加水至加水至100 ml，棕色瓶，棕色瓶4保存。保存。1.5 mol /L Tris-Hcl分离胶缓冲液分离胶缓冲液pH8.

6、8（4x） 取取18.15 g Tris， 用用1M HCl调调pH至至 8.8，加水，加水 至至100 ml，4保存保存0.5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液pH6.8 （4x） 取取5.98 g Tris，用，用1N HCl调至调至pH6.8，加水至，加水至 100 ml，4保存。保存。2021222324252627282930 用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分离胶顶端的距用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及溴酚蓝前沿距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率（离，按下式计算相对迁移率（R R）：）： 相对迁移率相对迁移率

7、= 样品迁移距离（样品迁移距离（cm）/ 指示剂迁移距离（指示剂迁移距离（cm） 以标准蛋白质以标准蛋白质MMr r的常用对数（的常用对数（lg lgMMr r）对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋）对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子量的常用对数，再换算出其相对分白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子量的常用对数，再换算出其相对分子量。子量。313233 凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子量的大小。由于不同排阻范围的凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子量的大小。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶具有特定的蛋白质分子

8、量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之葡聚糖凝胶具有特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析，以每种蛋间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积，从标准曲线上可以求出此未知蛋样的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积，从标准曲线上可以求出此未知蛋白质对应的分子量。白质对应的分子量。3

9、4353637 分离条件温和分离条件温和 回收率高回收率高 重复性好重复性好 设备简单设备简单 对样品的稀释大对样品的稀释大 流速慢流速慢 操作费时操作费时3839 质谱仪是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子质谱仪是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经过加速进入磁场中。其动能与加速电压及电荷电离后经过加速进入磁场中。其动能与加速电压及电荷Z Z有关。有关。Z Z：电荷数：电荷数 ZeU=mvZeU=mv2 2/2 e/2 e：电荷：电荷(e = 1.60 x10(e = 1.60 x10-19-19C)C)U U：加速电压：加速电压

10、m m：离子的质量：离子的质量v v：离子被加速后的运动速度：离子被加速后的运动速度40 具有速度具有速度v v的带电离子进入质谱仪的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各的带电离子进入质谱仪的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按种离子按m/zm/z进行分离。进行分离。 根据质量分析器的工作原理，可将质谱仪分为动态和静态仪器两大类，静态仪器采用根据质量分析器的工作原理，可将质谱仪分为动态和静态仪器两大类，静态仪器采用稳定的电磁场，按空间位置来区别稳定的电磁场，按空间位置来区别m/zm/z不同的离子。动态仪器采用变化的电磁场，按时间不同的离子。动态仪器采用变化的电磁场，按时间不

11、同来区分不同来区分m/zm/z不同的离子。不同的离子。 分离生物大分子多采用电喷质谱法，属于动态质谱仪。基本原理是生物大分子在很分离生物大分子多采用电喷质谱法，属于动态质谱仪。基本原理是生物大分子在很高的电场下电离。样品溶液以很低的流速，在高的电场下使生物分子从毛细管中流出來。高的电场下电离。样品溶液以很低的流速，在高的电场下使生物分子从毛细管中流出來。41 样品溶液以很低的流速样品溶液以很低的流速(1-20l/(1-20l/分钟分钟) )从毛细管中流出来。在毛细管的柱头上施加一个高从毛细管中流出来。在毛细管的柱头上施加一个高电压电压(1-5kv)(1-5kv)，使柱头液体雾化成很细的带电液滴

12、，这种带电液滴在逆向干燥气流中挥发，使，使柱头液体雾化成很细的带电液滴，这种带电液滴在逆向干燥气流中挥发，使液滴表面电荷密度增大。直到产生的库仑斥力与液滴表面张力的雷利极限值相等时，液滴就会液滴表面电荷密度增大。直到产生的库仑斥力与液滴表面张力的雷利极限值相等时，液滴就会发生爆裂，形成更小的子液滴，这些子液滴又被蒸发，又会形成爆裂。如此循环下去，直到液发生爆裂，形成更小的子液滴，这些子液滴又被蒸发，又会形成爆裂。如此循环下去，直到液滴变得非常小，它的表面的电荷密度变得非常大，形成很强的电场，并从液滴中解离出带多电滴变得非常小，它的表面的电荷密度变得非常大，形成很强的电场，并从液滴中解离出带多电

13、荷的分子离子。这些离子是靠吸附上或丢失若干质子而形成的，所以正离子或负离子谱上会观荷的分子离子。这些离子是靠吸附上或丢失若干质子而形成的，所以正离子或负离子谱上会观察到谱峰。生物大分子在察到谱峰。生物大分子在ESIESI谱上往往是一组带不同的电荷的分子离子峰。谱上往往是一组带不同的电荷的分子离子峰。4243 核磁共振波谱核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR).(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR).是将具有磁矩的核放入磁场是将具有磁矩的核放入磁场后，用适宜的频率的电磁波照射，

14、它们就会吸收能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振后，用适宜的频率的电磁波照射，它们就会吸收能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振信号，得到核磁共振波谱。在有机化合物中，经常用于信号，得到核磁共振波谱。在有机化合物中，经常用于1 1H H和和1313C C核的共振吸收波谱。在生物学方面主核的共振吸收波谱。在生物学方面主要研究生物大分子的结构和分子量。到目前为止，采用要研究生物大分子的结构和分子量。到目前为止，采用1 1H 2D-NMRH 2D-NMR（二维（二维NMRNMR）能解决的最大蛋白质分）能解决的最大蛋白质分子量在子量在10000Da10000Da左右。如果采用杂核多维左右

15、。如果采用杂核多维NMRNMR技术，能解决的最大蛋白质分子量大在技术，能解决的最大蛋白质分子量大在25000Da25000Da左右。左右。44方法方法机理机理分子量计算分子量计算关键技术关键技术特点特点电泳电泳分子表面电荷分子表面电荷电泳条带电泳条带(mR)SDS包裹包裹单链分子单链分子层析层析分子质量分子质量层析峰的位置层析峰的位置介质交联度介质交联度球形分子球形分子质谱质谱质荷比质荷比质谱峰直接标识质谱峰直接标识样品质子化样品质子化整体分子整体分子核磁核磁核磁共振波谱核磁共振波谱核磁谱线计算核磁谱线计算磁场能量磁场能量整体分子整体分子45;.4647改变蛋白质的药代动力学改变蛋白质的药代动

16、力学调节蛋白质的稳定性以及活性调节蛋白质的稳定性以及活性改变蛋白质的空间构象改变蛋白质的空间构象484950反应条件的选择反应条件的选择 考虑因素包括考虑因素包括pH、反应温度、反应介质以及缓冲液组成、反应温度、反应介质以及缓冲液组成 允许反应顺利进行允许反应顺利进行 不能造成蛋白质的不可逆变性不能造成蛋白质的不可逆变性 有利于专一性修饰蛋白质有利于专一性修饰蛋白质 5152二硝基氟苯法二硝基氟苯法(FDNB,DNFB): 1945年年Sanger提出此方法提出此方法.53二甲基氨基萘磺酰氯法二甲基氨基萘磺酰氯法,丹磺酰氨基酸具有强烈的黄色荧光丹磺酰氨基酸具有强烈的黄色荧光,灵敏性是灵敏性是D

17、NFB法的法的100倍倍.5455巯基的氧化还原反应可以应用于蛋白质结构分析、包涵体的复性、增加巯基的氧化还原反应可以应用于蛋白质结构分析、包涵体的复性、增加蛋白质可溶性等。蛋白质可溶性等。56575859Figure Inclusion bodies expressed in E.coli.6061626364PEG是由乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料,分子组成为HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH; PEG链还可以与马来酸酐进一步共聚形成梳状的PEG衍生物,简称PM。 PEG分子中存在的大量乙氧基能够与水形成氢键,使PEG具有良好的水溶性;分子末端剩余

18、的羟基通过适当方式活化后可与各类蛋白分子相偶联。65 由于由于PEG无毒无毒,具有良好生物相容性和血液相容性具有良好生物相容性和血液相容性,使它成为一种被广泛使用的使它成为一种被广泛使用的生物修饰材料。对于各种具有药用潜能的蛋白来说生物修饰材料。对于各种具有药用潜能的蛋白来说,采用采用PEG修饰的目的主要有以修饰的目的主要有以下三个方面下三个方面:(1)增加稳定性增加稳定性,延长血浆半衰期延长血浆半衰期;(2)降低免疫原性和抗原性降低免疫原性和抗原性;(3)降低毒副降低毒副作用。作用。661 增加稳定性和延长血浆半衰期增加稳定性和延长血浆半衰期 一些以注射方式使用的药用蛋白一些以注射方式使用的

19、药用蛋白,由于在血液中存留的时间过短由于在血液中存留的时间过短,在很大程度上限制了在很大程度上限制了其正常药效的发挥。通过其正常药效的发挥。通过PEG修饰修饰,一方面增加了分子量一方面增加了分子量,降低了肾脏的排泄速率降低了肾脏的排泄速率;另一方另一方面面,偶联的偶联的PEG链在蛋白分子表面产生空间位阻效应链在蛋白分子表面产生空间位阻效应,减弱了血液中各种水解酶对蛋白的水减弱了血液中各种水解酶对蛋白的水解作用解作用,从而有效地延长了蛋白在循环系统内的保留时间。从而有效地延长了蛋白在循环系统内的保留时间。672降低抗原性和免疫原性降低抗原性和免疫原性 通过通过PEG修饰来消除免疫反应活性修饰来消

20、除免疫反应活性,将异源性蛋白转化为非免疫原性的药用蛋白将异源性蛋白转化为非免疫原性的药用蛋白,主要主要是利用无免疫原性的是利用无免疫原性的PEG分子链与蛋白表面的基团相偶联分子链与蛋白表面的基团相偶联,进而在蛋白表面形成一道屏障进而在蛋白表面形成一道屏障,将暴露的抗原结合位点屏蔽起来。分子构型独特的梳状将暴露的抗原结合位点屏蔽起来。分子构型独特的梳状PEG具有更强的屏蔽功能具有更强的屏蔽功能,因而在因而在这方面的应用更为普遍。这方面的应用更为普遍。683降低毒副作用降低毒副作用 通过基因重组技术获得的大规模生产的通过基因重组技术获得的大规模生产的TNF-a a,IL-2 和和IFN-g g等是

21、一类很有前途的抗肿瘤等是一类很有前途的抗肿瘤新药。但由于它们的血浆半衰期短新药。但由于它们的血浆半衰期短,为达到显著的临床治疗效果不得不加大使用剂量为达到显著的临床治疗效果不得不加大使用剂量,这就常这就常常引起严重的毒副作用。近年来发现常引起严重的毒副作用。近年来发现,利用利用PEG修饰技术对这些蛋白进行处理后修饰技术对这些蛋白进行处理后,能够大大增能够大大增加其血浆稳定性加其血浆稳定性,降低使用剂量降低使用剂量;或在大的使用剂量下降低毒副作用。近年来或在大的使用剂量下降低毒副作用。近年来,PEG修饰已成为修饰已成为提高其抗肿瘤效能、降低毒副作用的有效手段。提高其抗肿瘤效能、降低毒副作用的有效

22、手段。69 蛋白药物的蛋白药物的PEG修饰已卓有成效，国际知名的制药公司已经或正在积极推进蛋白药修饰已卓有成效，国际知名的制药公司已经或正在积极推进蛋白药物的物的PEG修饰，修饰，1991年第一种用年第一种用PEG修饰的蛋白药物修饰的蛋白药物PEG-ADA被被FDA批准上市，近几批准上市，近几年上市的有年上市的有PEG-IFN、PEG-G-CSF、PEG-生长抑素。目前处于临床前研究的生长抑素。目前处于临床前研究的PEG修饰修饰的蛋白药物有几十种，处于临床实验的有：超氧化物歧化酶（即将上市，的蛋白药物有几十种，处于临床实验的有：超氧化物歧化酶（即将上市，Enzon公司）、公司）、白介素白介素-

23、2（期，期，Chiron公司）、水蛭素（公司）、水蛭素（期，期，BASF AG公司）、抗公司）、抗-TNF-a a抗体片段抗体片段（期，期，Pharmacia公司）、牛血红蛋白（公司）、牛血红蛋白（期，期，Enzon公司）、抗公司）、抗-PDGF抗体片段（抗体片段（期，期，Celltech公司）。公司）。707172737475767778 TNF-a a是一种颇有价值的肿瘤治疗药物是一种颇有价值的肿瘤治疗药物, 一方面直接表现为对肿瘤细胞的细胞毒作一方面直接表现为对肿瘤细胞的细胞毒作用用;另一方面可激活宿主的抗肿瘤应答并选择性地引起肿瘤组织内部的微循环障碍。但另一方面可激活宿主的抗肿瘤应答并

24、选择性地引起肿瘤组织内部的微循环障碍。但是是, TNF-a a在体内的清除速率很快在体内的清除速率很快,要产生明显的抗肿瘤效果需要非常大的使用剂量要产生明显的抗肿瘤效果需要非常大的使用剂量,由此由此常引发一系列严重的毒副作用常引发一系列严重的毒副作用,包括发热、组织炎症和组织损伤包括发热、组织炎症和组织损伤,甚至是致命的内毒素性甚至是致命的内毒素性休克样综合征。要将其转化为一种有效的抗肿瘤药物必须有效地降低毒副作用休克样综合征。要将其转化为一种有效的抗肿瘤药物必须有效地降低毒副作用,PEG修饰修饰正是为达到这一目的。研究表明正是为达到这一目的。研究表明,利用利用PEG 5000对对TNF-a

25、a进行化学修饰进行化学修饰,通过对修饰条件通过对修饰条件的优化处理的优化处理,不仅能够有效减少毒副作用不仅能够有效减少毒副作用,还可提高其抗肿瘤活性。当赖氨酸残基被修饰还可提高其抗肿瘤活性。当赖氨酸残基被修饰的程度分别为的程度分别为29%和和56%时时,其抗肿瘤活性分别增加了其抗肿瘤活性分别增加了4倍和倍和100倍。与天然倍。与天然TNF-a a相比相比,修饰产物的分子量明显增大修饰产物的分子量明显增大,延长了药物的有效作用时间延长了药物的有效作用时间,降低了毒副作用降低了毒副作用,促进了它作为促进了它作为抗肿瘤药物的应用。抗肿瘤药物的应用。7980Figure Schematic protocol of PEGylation of TFN-a using DMMAn. Reaction I, protection of partial amino groups by DMMAn; reaction II, PEGylati