分子生物学重点(2)

1、分子生物学重点一、 名词解释1、冈崎片段：是在DNA半不连续复制中产生的长度为10002000个碱基的短的DNA片段，能被连接形成一条完整的DNA链。3、重组DNA技术：又称基因工程，将不同的DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照预先的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状的技术。4、穿梭质粒：一个质粒含有两种宿主细胞的复制起点，可在两种细胞中复制和存在，谓之穿梭质粒。5、锌指结构：锌指结构家族蛋白大体可分为锌指、锌钮和锌簇结构，大约由30个氨基酸残基构成的蛋白质超二级结构，其中两个Cys（半胱氨酸）和两个His与锌离子结合形成四面体锌

2、指结构参与DNA的合成6、螺旋转折螺旋结构：这一类蛋白质分子中有至少两个a螺旋，中间由短侧连氨基酸残基形成“转折”，近羧基端的a螺旋中氨基酸残基的替换会影响该蛋白质在DNA双螺旋大沟中的结合。7、SD序列：存在于原核生物起始密码子AUG上游712个核苷酸处的一种47个核苷酸的保守片段，它与16S rRNA 3端反向互补，所以可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。8、RNA干扰（RNAi）：是利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因确实表型的方法。9、PCR：聚合酶链反应，一种在体外（试管、切片）扩增核酸的技术10

3、、基因芯片：在一微小基片的表面集成大量DNA分子探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。（指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后对杂交信号的监测分析，即可获得样品的遗传信息。）11、复制子： 单独复制的一个DNA单元被称为一个复制子，它是一个可移动的单位，一个复制子在任何一个细胞周期只复制一次。12、启动子上升突变：TATGTTTATATT,转录效率上升,为上升突变启动子下降突变：TATAATAATAAT,转录效率下降,称为下降突变13、编码链（有意义链）：与mRNA序列相同的DNA链。14、反义链

4、（模板链）：为模板指导mRNA合成的DNA链。15、C值反常现象：也称为C值谬误。指C值往往与种系的进化复杂性不一致的现象，即基因组大小与遗传复杂性之间没有必然的联系，某些较低等的生物C值却很大，如一些两栖动物的C值甚至比哺乳动物还大。16、分子接头：在DNA的末端加上一段限制性内切酶的识别序列，随后用限制酶切出所需要的粘性末端，使DNA的平端连接得以转变成为较易进行的粘性末端连接。这种含限制酶识别序列的DNA片段称为接头。17、限制性内切酶：是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。 18、剪接体：在剪接过程形成的剪接复合物称为剪接体，剪接体

5、的主要组成是蛋白质和核内小分子RNA（snRNP）。19、感受态细胞：能够高效吸收外界DNA的细胞，是一种生理状态，可以人工诱获。20、RNA编辑：使mRNA的序列发生不同于模板DNA的变化，导致了遗传信息的改变。（指mRNA在转录后因插入、缺失或核苷酸的替换，改变了DNA模板来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质。）21、原位杂交技术（ISH）：用标记的核酸探针（放射自显影或非放射性技术），在组织、细胞、间期核及染色体对核酸进行定位和相对定量分析。22、 5帽子结构：转录起始以A为主，G为次，所形成的转录物的5端并非5PPPAPNPNP-，而是5-5三磷酸联接起来的二核苷酸，加

6、上去的是“G”，是由鸟苷酸转移酶完成。以倒扣方式，一般是5-3连接。特定位置甲基化后就成为“帽子”。23、尾巴结构： 大多数真核mRNA具有polyA尾巴（polyA+），但亦有少部分没有（polyA-）。长度40200，由RNA末端腺苷酸转移酶合成，非模板合成。在有AAUAAA的保守序列下游1025核苷酸处切断，并加polyA。24、重叠基因:具有部分共用核苷酸序列的基因，即同一段DNA携带了两种或两种以上不同蛋白质的编码信息。25、碱性-亮氨酸拉链：蛋白羧基端35个氨基酸残基形成螺旋，每隔6个有一个亮氨酸残基，形成亮氨酸位于一边的螺旋（相当于拉链的一半），与另一相同的蛋白的螺旋结合，由两个

7、螺旋的亮氨酸一侧形成疏水区（形成拉链）；蛋白的氨基端2030富含碱性氨基酸。26cDNA：在体外以mRNA为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA27、DNA半保留复制：DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。这样形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。28、DNA的半不连续复制：DNA复制的过程中前导链的复制时连续的，而另一条链，即后随链的复制是中断的，不连续的。29、RACE：是利用PCR技术在已知部分cDNA序列的基础上特异性克隆其

8、5端或3端缺失序列的方法。30、T-DNA：根癌农杆菌Ti或Ri质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组中，是植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。31、安慰性诱导物：指的是与转录调控中实际诱导物相似的一类高效诱导物，但不是该诱导酶的底物。32摆动假说：crick为了解释反密码子中某些稀有成分（如I)的配对以及许多氨基酸有2个以上密码子的问题而提出的假说33操纵子:是指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。34单顺反子mRNA：只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA。35蛋白质磷酸化：指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷

9、酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，是生物体内一种普遍的调节方式，在细胞信号转导的过程中起着重要作用。36多聚A位点（polyA位点）:在多聚A聚合酶的催化下，在mRNA前体3端接上一个约200250个腺嘌呤核苷酸（A）的尾巴，起到稳定mRNA的作用。37多顺反子mRNA：一种能作为两种或多种多肽链翻译模板信使RNA，由DNA链上的邻近顺反子所界定。38反式作用因子：是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。39复制叉：复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行DNA合成，所以，复制起点呈叉子形状，被称为复制叉子。40核小体：是染色质的基本结构单

10、位，由大约200bp的DNA和组蛋白八聚体及外围H蛋白所组成。41后随链：在DNA复制过程中，与复制叉运动方向相反的方向不连续延伸的DNA链被称为后随链或滞后链。42基因定点突变：向靶DNA片段中引入所需的变化，包括碱基的添加。删除或改变，是分子生物学研究中一种非常有用的手段。43基因克隆：在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，转入宿主细胞使之得以永久保存和复制的过程称为基因克隆。44顺反子：功能基因，意为通过顺式（基因序列）及反式（所编码的蛋白质）实验所确定的一个遗传学单位。45顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子，增强子，调控序列和

11、可诱导元件等，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。46引发酶：是依赖于DNA的RNA聚合酶，其功能是在DNA复制过程中合成RNA引物。47引发体：DNA复制过程中引发合成每个冈崎片段时所需的多蛋白复合物，包括预引发蛋白、具有ATP酶活性的蛋白质以及引物酶。48引物：是指一段较短的单链RNA或DNA，它能与DNA的一条链配对提供游离的3-OH末端以作为DNA聚合酶合成脱氧核苷酸链的起始点。1.将外源基因导入的方法常用的基因工程真核细胞包括酵母细胞、动物细胞和植物细胞。（1）外源基因导入酵母细胞：在对酵母细胞进行外源DNA转化时，一般先需要用酶将其细

12、胞壁消化水解，变成原生质体。蜗牛消化酶具有纤维素酶、甘露聚糖酶、葡萄糖酸酶以及几丁质酶等，对酵母菌细胞壁有良好水解作用。原生质体在氯化钙和聚乙二醇存在下，重组DNA能容易地被宿主细胞吸收，转化的原生质体悬浮在营养瓶中，即可再生出新的细胞壁。（2）外源基因导入动物细胞常用的方法有：1.磷酸钙共沉淀法。2.DEAE-葡聚糖或聚阳离子，它们能结合DNA并促使细胞吸收；3.脂质体法4.脂质转染法5.电穿孔法6.显微注射法（3）外源基因导入植物细胞常用的方法有：1.转化法2.电穿孔和脂质体法3.显微注射法5.基因枪法4.农杆菌感染法：根瘤农杆菌的Ti质粒上有一段T-DNA ，又称转移DNA，能携带外源基

13、因转移到植物细胞内，并整合到染色体DNA中，因此Ti质粒是目前植物基因工程中最常用的理想的基因载体。2.核糖体活性中心（核糖体的活性位点）（1）mRNA结合位点（2）P位点（3）A位点（4）肽基转移酶活性位点（转肽酶中心）（5）5SrRNA位点（50S上） （6）E位点（50S上） 与氨酰基tRNA释放有关。大小亚基在合成中的分工小亚基：对mRNA特殊序列的识别（SD序列）密码子与反密码子的相互作用。大亚基：AA-tRNA，肽基tRNA的结合，肽键的形成等。3.凝胶电泳（操作的主要因素） 技术原理流程图目的：分离不同的DNA分子电泳迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度。影响迁移率的因素：（1

14、）与电场强度、电泳分子净电荷成正比；（2）与电泳分子的摩擦系数成反比分子摩擦系数为分子大小、极性、介质粘度的函数。.DNA和RNA在电场中为多聚阴离子，电泳时向正极移动。速度在于分子大小和构型。.电泳介质：一般用琼脂糖和聚丙烯酰胺，浓度与所分离的DNA和RNA的大小有关。（表）.染色剂：溴乙锭4.噬菌体，cDNA文库建立的基本过程：cDNA：以mRNA为模板，利用逆转录酶（反转录酶）合成的DNAcDNA文库（过程）：由cDNA的一套随机片段构成，其中每个片断连在一个单独的载体分子上，储存在宿主（大肠杆菌、噬菌体等）中。建立cDNA文库的意义：含有生物大部分基因，不含内含子序列，方便基因的筛选、

15、克隆；特别可以获得特殊器官、组织和特殊时期表达的基因等。主要技术步骤：（1）高质量mRNA的制备 （2）反转录生成cDNA （3）与噬菌体载体分子连接 （4）噬菌体的包装3DNA和cDNA文库的建立A 基因组DNA文库：将某生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆的汇总，就谓之。用途：基因组测序，特定基因的分离等。步骤：1. 制备大小合适的随机DNA片段； 2. 将这些片段与适当载体结合形成重组子； 3. 转化到微生物细胞中； 4. 筛选有目的片段的克隆。（图）要求：全部克隆所含的DNA片段必需覆盖整个基因组。随机切割和增加克

16、隆数目可以提高代表性。n 载体与克隆能力：噬菌体 1520kb柯斯质粒 45kb细菌人工染色体（BAC）酵母人工染色体（YAC）等 701000kbRACE技术基因敲除技术：基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点基因芯片：在一微小基片的表面集成大量DNA分子探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。（指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后对杂交信号的监测分析，即可获得样品的遗传信息。

17、）RNAi技术原理乳糖操纵子。、反式作用因子 顺式作用元件13.DNA的大小沟的作用P34形成沟状结构是DNA与蛋白质相互作用所必需的，这样DNA结合蛋白与DNA修饰蛋白中特定的氨基酸才能与对应的碱基相互作用。前导链，后随链 ：RNA引物 合成物质mRNA修饰 填空题1.已知核糖体上有哪些活性部位？它们在多肽合成中各起什么作用？答：核糖体上具有一系列与蛋白质合成有关的结合位点与催化位点：与mRNA的结合位点；与新掺入的氨酰tRNA的结合位点氨酰基位点，又称A位点，又叫受位；与延伸中的肽酰tRNA的结合位点肽酰基位点，又称P位点，也叫供位；肽酰转运后与即将释放的tRNA的结合位点E位点，是中间听

18、靠站；与肽酰tRNA从A位点转移到P位点有关的转移酶(即延伸因子EF-G)的结合位点；肽酰转移酶的催化位点。此外还有与蛋白质合成有关的其他起始因子、延伸因子和终止因子的结合位点。核糖体的活性位点（1）mRNA结合位点 位于30S亚基的头部，16S 3端（2）P位点 由30亚基（大部）50亚基（小部）组成，供肽酰tRNA结合。亦可与起始tRNA即fMet-tRNA相结合。（3）A位点 主要由50S亚基上的活性部位组成，供AA-tRNA结合。（4）肽基转移酶活性位点（转肽酶中心） 位于P位与A位连接处。（5）5SrRNA位点（50S上） 靠近转移酶位点，可能与tRNA进入有关。（6）E位点（50S

19、上） 与氨酰基tRNA释放有关。2.原核生物基因组特点：（1）结构简练。除必要的间隔，不转录的序列极少。（2）存在转录单元。多顺反子mRNA和操纵子。（3）有重组基因。a基因套另一个基因，b部分重叠c只有一个碱基重叠，阅读框相同和不相同。真核生物基因组特点：（1）真核基因组庞大。（2）真核基因组存在大量的重复序列。（3）真核基因组大部分为非编码序列，占90%以上。（4）真核基因组的转录产物为单顺反子。（5）真核基因组是断裂基因，有内含子结构。（6）真核基因组存在大量的顺式作用元件。（7）真核基因组中存在大量的DNA多态性。（8）真核基因组具有端粒结构。3.用于基因克隆的常用酶：脱氧核糖核酸酶、

20、核糖核酸酶、DNA聚合酶、末端转移酶、TaqDNA聚合酶、同尾酶、同裂酶。一、限制性内切酶 二、甲基化酶 三、T4-DNA连接酶 四、核酸酶 五、聚合酶六、DNA修饰酶表1 基因工程常用的工具酶酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，DNA聚合酶I或其大片段（1）缺口平移制作标记DNA探针（2）合成cDNA第二链（3）填补双链DNA3凹端（4）DNA序列分析耐热DNA聚合酶聚合酶链反应DNA连接酶连接两个DNA分子或片段多核苷酸激酶催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备末端标记探针末端转移酶在3末端加入同质多聚物尾SI核酸酶降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端DNA端酶I降解D

21、NA，在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解去除RNA磷酸酶切除核酸末端4.DAN的结构DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。通常情况下,DNA的二级结构分两大类: 右手螺旋(A-DAN,B-DNA)和左手螺旋(Z-DNA). DNA的两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴构成螺旋结构.多核苷酸的方向由核苷酸间的磷酸二酯键的走向决定,一条从5'3',另一条从3'5'.链间有螺旋型的凹槽,其中一条较浅,叫小沟;一条较深,叫大沟.两条链上的碱基以氢键相连,DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构.超螺旋结构是D

22、NA高级结构的主要形式,可分为正超螺旋与负超螺旋两大类.5.真核生物染色体的结构（1）真核细胞染色体的组成真核细胞的染色体由DNA,组蛋白,非组蛋白及部分RNA组成,其蛋白质与相应DNA的质量比约为2:1.（2）染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白.组蛋白是染色体的结构蛋白,它与DNA组成核小体（3）真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列,而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开.许多DNA序列不编码蛋白质,是无生理功能的.真核细胞DNA序列大致上可被分为3类: (1)不重复序列(2)中度重复序列(3)高度重复序列卫星DNA（4）染色质和核小体由DNA和组蛋白组成的

23、染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构.核小体是由H2A,H2B,H3,H4各两个分子生成的8聚体和由大约200bpDNA组成的6 原核生物聚合酶的结构及各部分功能答：聚合酶全酶核心酶因子 核心酶又由2个亚基，一个亚基，一个 亚基和一个亚基组成。功能：核心酶催化转录的延长过程；因子辨别转录起点。核心酶各部分功能：亚基：使酶专一识别模板上的启动子；帮助核心酶选择模板链。亚基和 亚基：和共同形成RNA合成的活性中心。7 mRNA的剪接方式 答：组成型剪接：有序的，固定的剪接方式。特异性剪接：有选择的，非固定的剪接方式，内含子的变位剪接。果蝇性别分化相关基因的特异性剪接（图） 8 真核生物DNA

24、分类 答：（1）不重复序列：这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的大多数；基因扩增（放大作用）；一般为结构基因。（2）中度重复序列：这些序列的重复次数在10-104 ，占总DNA的10%-40%。例如，tRNA基因；rRNA基因；组蛋白基因等。 （3）高度重复序列_卫星DNA 这类DNA只在真核生物中发现；离心时可显示出多个峰；是异染色质的组成部分。9 细胞RNA种类答：RNA可分成多种类型，除信使RNA（mRNA），转移RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）外，还有真核生物结构基因转录产生的mRNA前体分子，因分子大小很不均一，称核内不均一RNA(hnRNA)。许多种小分子R

25、NA，如核内小RNA(snRNA)，反义RNA(asRNA)等。10 原核基因的调节机制及特点。（不确定，仅供参考。原题是原核细胞调节特点）答：负调节（负转录调控）：调节物为抑制物，使转录关闭，解除抑制的物质称为诱导物。 正调节（正转录调控）：调节物为激活物，使转录开放。正、负调节可以同时在一个调节系统中起作用。11、常见的DNA结合域结构形式包括：锌指结构、螺旋-转角-螺旋结构、碱性-螺旋-环-螺旋、碱性-亮氨酸拉链结构12、基因表达调控可在多个层次上进行，包括基因（染色体）水平、转录水平、转录后（RNA加工成熟）水平、翻译水平、翻译后（蛋白质加工）水平13、原核生物RNA聚合酶的组分：核心

26、酶（2个亚基、一个亚基、一个亚基、和一个亚基组成）+亚基14、真核生物染色体的基本成分：DNA、组蛋白、非组蛋白、部分RNA; 核小体的组成：由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和大约200bp的DNA组成。简答题1、 DNA变性复性的含义和条件DNA变性：在加热或强酸或碱性作用的条件下，DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离，形成单链DNA的过程。DNA复性：在解除变性的条件后，变性的单链DNA重新结合起来，形成双链，其原有的特性和活性可以恢复的过程。、mRNA在总RNA所占比例少的原因（）mRNA的半衰期 。短转录开始1min后，降解可能就已经开始。一般半衰期为2min。转录蛋白的

27、量取决于转录和翻译的起始效率。 （2）DNA转录的mRNA少(3)容易降解3、蛋白质的合成所需蛋白因子起始因子：IF-1 促进IF-2，IF-3的功能；IF-2 协助fMet-tRNAfmet 与30S亚基结合，进而进入P位;IF-3 促进70S核糖体解离（对前一次合成），促进mRNA 与30S亚基结合。延伸因子：EF-Tu 协助将AA-tRNA带入A位，不能与起始tRNA作用; EF-Ts 使行使功后的EF-Tu.GDP重新活化，再生位EF-Tu.GTP EF-G 负责延伸过程中的移位、耗能，肽基tRNA从AP,mRNA移动一个密码子的距离。终止因子：识别终止密码，终止合成，释放核糖体。RF

28、-1：识别UAA，UAGRF-2：识别UAA，UGA ;RF-3：协助上述两个因子。4、原核生物代谢作用：葡萄糖对其他糖代谢的影响（葡萄糖效应）葡萄糖在糖酵解途径中产生的某些代谢物是腺苷酸环酶活性的抑制剂，腺苷酸环酶活性是ATP转化成cAMP的催化剂。当原核生物内有葡萄糖时，在葡萄糖代谢的影响下cAMP的量减少，cAMPCRP复合物减少而无法启动乳糖操纵子的正调节，乳糖操纵子不表达5、不同碱基合成核苷酸链破译密码子 理论上的推测：mRNA有四种核苷酸，而蛋白质中有20种氨基酸。若二联子：排列方式有4216种，不够代表20种氨基酸。若三联子：排列方式有4364种，即有64种密码子 ，可以满足20

29、种氨基酸的需要。6、组蛋白与非组蛋白有哪些生物特性组蛋白的生物特性：1）进化上的保守性（2）无组织特异性 （3）氨基酸分布不对称（4）化学修饰：磷酸化 甲基化 乙酰化（5）组蛋白H5具有种特异性非组蛋白的生物特性：（1）多样性（2）组织专一性（3）种属专一性 7.操纵子（lac,trp弱化） 原核生物中为功能相关的几个蛋白质编码的一组结构基因，加上启动序列、操纵序列以及其它调节序列串联组成的转录单位称为操纵子。（1） 乳糖操纵子的组成和功能 结构基因lacZ、lacY、lacA。编码利用乳糖的三个酶（-半乳糖苷酶、透性酶、乙酰基转移酶）； 启动基因lacP。RNA聚合酶识别位点； 操纵基因la

30、cO。阻遏蛋白结合位点； 调节基因lacI。编码阻遏蛋白，阻遏蛋白与lacO结合，使操纵子受阻遏而处于转录抑制； 在lacP上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点。（2） 乳糖操纵子的调控机制 阻遏蛋白的负性调节：lacI表达的阻遏蛋白与lacO结合，阻止RNA聚合酶起始转录结构基因，异构糖可结合阻遏蛋白，使其变构而与lacO解离。 CAP的正性调节：cAMP与CAP结合，启动正性调节，CAP-cAMP复合物结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，促进结构基因转录。 协调调节：当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；但如果没有CAP来加强转录活性，即使阻遏蛋白从操纵序列上解

31、离仍无转录活性。（3） 色氨酸操纵子包括：启动子、调节基因及五个结构基因，分别编码色氨酸合成有关的5种酶。色氨酸操纵子具有负控阻遏调节系统：环境中有色氨酸时，色氨酸与辅阻遏蛋白结合形成有活性的阻遏物，与操纵子结合关闭色氨酸mRNA的转录。色氨酸操纵子还具有弱化子调控系统：弱化子是具有终止作用的DNA序列，这种终止作用是可以被调节的。（4）弱化子调控的过程：色氨酸操纵子具有前导序列，弱化子位于前导序列上。前导序列可分为1、2、3、4区，其中可出现1区和2区配对，区和4区配对或2区和3区配对两种情况。当出现1区与2区配对，3区和4区配对时是终止转录信号，而2区与3区配对是可以继续转录下去的。当环境

32、中色氨酸浓度高时，形成1区与2区配对，3区和4区配对，RNA聚合酶可以通过弱化子，使转录继续进行。这个阶段是trp操纵子的细微调控。 8.构建分子克隆载体所需的条件？分子克隆的步骤？分子克隆载体所需条件：能在宿主细胞内独立进行高效的自我复制。具备比较容易识别的筛选标志。分子量大小适当，与载体的外源基因大小有关。容易进入宿主细胞。具有适当的限制性内切酶的单一酶切位点，即多克隆位点，该位点通常不能位于选择性标记基因内。高拷贝。分子克隆步骤：目的基因的制备。 基因载体的选择。 目的基因和载体的剪切。 目的基因和载体的连接。 宿主细胞的转化（重组DNA分子导入宿主细胞，从而获得新的遗传特性）。 重组体

33、的筛选和鉴定。 克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化。 可简单地概述为：分、切、接、转、筛、捡。9.基因定点突变的技术原理 对已知基因序列设计突变位点，合成短核苷酸引物，突变的核苷酸包含其中。与原基因进行分子杂交，再复制扩增，成为带有突变位点的新基因（或基因片段）。 10真核生物内含子被剪切（剪切类型、接口类型等） 序列分析表明，几乎每个内含子5端起始的两个碱基都是GT，而3端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的高度保守性和广泛性，有人把它称为GT-AG法则，即：5GTAG3。由于内含子两末端的序列不同，可定向表明内含子的两个末端，根据剪接加工过程沿内含子自左向右进行的原则，一般将内含子

34、5端接头序列称为左剪接位点，3端接头序列称为右剪接位点，有时也将前者为供体位点，将后者称为受体位点。 11.原核基因转录能精确进行相关的序列、结构 必不可少的三个序列：-35(RNA聚合酶结合位点)、-10(RNA荣合酶起始位点)启动子序列和终止子； 12.安慰性诱导物、作用、例子、定义。 答： 安慰诱导物是一种与天然诱导物结构相似的化合物，它虽然能诱导操纵子表达，但是它不能被操纵子基因产生的酶分解。在lac操纵子中异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是乳糖的类似物能代替异乳糖作为诱导物，但不能作为-半乳糖苷酶的底物进入代谢途径。 为了证实诱导物的作用是诱导新酶合成，而不是将已存在于细胞中的酶前体转

35、化成有活性的酶，科学家设计了同位素示踪实验。他们把大肠杆菌细胞放在有放射性35S标记的氨基酸但没有任何半乳糖苷诱导物的培养基中繁殖几代，然后再将这些带有放射活性的细菌转移到不含35S、无放射性的培养基中，随着培养基中诱导物的加入。-半乳糖苷酶便开始合成。分离纯化-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记，说明酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。P239 13.DNA的大小沟的作用P34形成沟状结构是DNA与蛋白质相互作用所必需的，这样DNA结合蛋白与DNA修饰蛋白中特定的氨基酸才能与对应的碱基相互作用。14转座子分类，转移特点P57 转座子是存在于染色体DNA上可自我复制和移位的

36、基本单位。转座子分为两大类：插入序列和复合型转座子。复合式转座子：带有抗药基因或其他宿主基因的转座子，其两翼是两个IS。形成复合转座子后，两侧的IS不可再单独移动。转移特点 来源参考书 可能的答案：1.保守型转座，即插入序列从原位点移至新位点2.复制型转座，即插入序列复制后，其中的一个拷贝移至新位点，另一个仍保留在原位点。15真DNA甲基化（增强，减弱）构象变化 P293 DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。研究表明，当组蛋白H1与含CCGG序列的甲基化或非甲基化DNA分别形成复合体时，DNA的构型存在着很大的差别

37、，甲基化达到一定程度时会发生从常规的BDNA向ZDNA的过渡。由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。有实验用序列相同但甲基化水平不同的为材料，比较其作为聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与聚合酶的结合，降低了其体外转录活性。16调控分子:e.g激素(激素受体蛋白)17.色氨酸操纵子作用机理可能的答案:（1）色氨酸操纵子包括 启动子,调节基因及五个结构基因,分别编码色氨酸合成有关的5种酶。（2）色氨酸操纵子具有负控阻碍调节系统 环境中有色氨酸时，色氨酸与辅阻遏蛋白结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合关闭色氨酸mRNA的转录。（

38、3）色氨酸操纵子还具有弱化子调控系统 弱化子是具有终止作用的DNA序列，这种终止作用是可以被调节的。色氨酸主要利用翻译转录的偶联作用对基问答题1真核启动子的顺势作用元件及反式作用因子:(1) 顺式作用元件（启动子、增强子），是启动子上下游的特定序列；A启动子核心启动子上游启动子元件启动子a.核心启动子: -25-30 的TATA区（TATA box），是控制转录起始精确性和基础水平的转录的序列。b.上游启动子元件（UPE）或上游激活序列（UAS）:- 70-80 CCAAT区（CAAT box），-80-110 GCCACACCC区，或GGGCGG区（GC box），控制转录的频率的序列。其他

39、UPE: ATGCAAAT等；所有的UPE的序列都与特定的转录因子有关。并非每一个基因的启动子区都包含这三个区。RNA聚合酶与UPE结合，机理尚不明。B 增强子：是增加转录速率的DNA序列。结构：增强子的亚单位谓之增强子元（单元）。一个增强子必需要两个或以上的亚单位（正向重复序列），而且紧密相连才有功能。特点：a 增强效应明显，10200倍b 远距离作用，无方向性，上游活下游都有作用c 大多重复序列，一般50bp，核心序列为TGGA/TA/TA/T(G),与蛋白因子结合d 有组织特异性，与特异转录因子结合才有功能e 没有基因的专一性,可以在不同的基因组合上表现增強效应例子：人巨大细胞病毒经增强

40、子增强后的珠蛋白基因表达频率比该基因正常转录高600-1000倍增强子可能有以下三种作用机理：a 影响模板附近DNA双螺旋结构，导致DNA双螺旋弯折或在反式作用因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子成环连接，活化转录基因b 将模板固定在细胞核内特定位置，入连接在核基质上，有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶在DNA链上的结合和滑动c 增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶进入染色质结构的“入口”（2） 反式作用因子A 基因的所有顺式作用元件包括UPE和增强子都要和相应的反式作用因子结合，并通过蛋白质之间的相互作用才能实现对转录的调控。B 功能性结构 螺旋转折螺旋（H-T-H）结构（图）结构特点：两个螺旋，中间以“转折”相连。与DNA结合区：近羧基端的螺旋。 锌指（zine finger）结构结构特点：一对半胱氨酸（Cys）和一对半胱氨酸，或一对半胱氨酸和一对组氨酸（