细胞核的分离与核酸的鉴定ppt课件

1、实验6 细胞核的分别与核酸的鉴定Separation of cell nuclei and identification of nucleic acids遵义医学院生化教研室遵义医学院生化教研室 1.1.掌握离心技术的原理及离心机的运用；掌握离心技术的原理及离心机的运用；2.2.熟习提取分别细胞核、细胞质的方法；熟习提取分别细胞核、细胞质的方法；3.3.熟习鉴定核酸的方法；熟习鉴定核酸的方法；一、核酸的种类及其分布一、核酸的种类及其分布请思索？请思索？ DNA、RNA在细胞中的分布：在细胞中的分布：DNA胞核内胞核内(98%)胞质内胞质内(2%)RNA胞核内胞核内(10%)胞质内胞质内(90%

2、) 核酸的种类：核酸的种类： DNA、RNA结论：结论：DNA主要存在于细胞核，主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。主要存在于细胞质。二、分别细胞质与细胞核二、分别细胞质与细胞核 .破碎细胞细胞破碎的方法细胞破碎的方法机械法机械法高速组织捣碎机高速组织捣碎机玻璃匀浆器玻璃匀浆器研钵研钵物理法物理法超声匀浆器超声匀浆器冻融法冻融法化学法化学法自溶法自溶法酶处置酶处置外表活性剂处置法外表活性剂处置法 利用各细胞器在一定介质中的沉降速度的差利用各细胞器在一定介质中的沉降速度的差别，可采取离心的方法，将细胞器分别出来。别，可采取离心的方法，将细胞器分别出来。.离心技术离心技术 细胞器沉降先后顺

3、序先后是细胞核、线粒细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。 离离 心心 方方 法法差速沉降离心法差速沉降离心法 速率区带离心法速率区带离心法等密度区带离心法等密度区带离心法密度梯度区密度梯度区带离心法带离心法 差速沉降离心法差速沉降离心法(differential (differential centrifugation)centrifugation) 采用逐渐添加离心速度或低速和高速交替进展离心，采用逐渐添加离心速度或低速和高速交替进展离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时使沉降速度不同的颗粒，在不同

4、的离心速度及不同离心时间下分批分别的方法。间下分批分别的方法。 加速加速 低速低速高速高速 差速沉降离心法普通用于分别沉降速度相差速沉降离心法普通用于分别沉降速度相差较大普通为差较大普通为1010倍的颗粒。倍的颗粒。缺陷：分别效果差，不能一次得到纯颗粒；缺陷：分别效果差，不能一次得到纯颗粒； 壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高 时，在离心管一侧会出现沉淀；时，在离心管一侧会出现沉淀； 颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗颗 粒变形、聚集而失活。粒变形、聚集而失活。v每种纯样品成份在介质溶液中的沉降速度可以表

5、为：每种纯样品成份在介质溶液中的沉降速度可以表为： v V=d218(-s)2r。V V： 是某一时辰样品的沉降速度厘米是某一时辰样品的沉降速度厘米/ /秒；秒；d d： 样品颗粒的直径厘米；样品颗粒的直径厘米；：样品颗粒的密度克：样品颗粒的密度克/ /厘米厘米3 3；s s： 介质溶液的密度克介质溶液的密度克/ /厘米厘米3 3；：介质溶液的粘性系数克：介质溶液的粘性系数克/ /厘米厘米秒；秒；：离心机重轴的旋转角速度：离心机重轴的旋转角速度1/1/秒，秒，=2N=2N6060，N N：转：转/ /分；分； r r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的间隔，即离心半径厘米；：颗粒所在位置与旋转轴心之

6、间的间隔，即离心半径厘米；密度梯度离心法的实际根据密度梯度离心法的实际根据 待分样品的沉浮行为如何确定？待分样品的沉浮行为如何确定？v当当S时时 V0即样品顺离心力方向沉降即样品顺离心力方向沉降S时时 V0即样品逆离心力方向上浮即样品逆离心力方向上浮=S时时 V=0即样品停顿沉降或上浮，即样品停顿沉降或上浮，“稳定在这稳定在这一位置一位置用这个公式可以很好地解释在速率区带离心法或用这个公式可以很好地解释在速率区带离心法或等密度区带离心法中单一样品的沉降或上浮等密度区带离心法中单一样品的沉降或上浮行为。行为。 速率区带离心法速率区带离心法 人为地参与不同密度的活性物质，构成一个较为平缓的人为地参

7、与不同密度的活性物质，构成一个较为平缓的介质梯度，将样品加在介质中进展离心，在一定的离心力下介质梯度，将样品加在介质中进展离心，在一定的离心力下根据颗粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，根据颗粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，构成不同区带的分别方法。构成不同区带的分别方法。 此法用于分别具有一定沉此法用于分别具有一定沉降速度差的颗粒沉降速度差降速度差的颗粒沉降速度差为为20% 或更少或分子量相差或更少或分子量相差3倍的蛋白质。适用于分别密倍的蛋白质。适用于分别密度类似而大小有别的样品。度类似而大小有别的样品。 样品在密度较高、密度梯度较为峻峭的介质溶液中样品在密度较高

8、、密度梯度较为峻峭的介质溶液中进展离心，具有不同密度的颗粒向上浮起，不断挪动进展离心，具有不同密度的颗粒向上浮起，不断挪动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，构成几条不同的区带，这就是等密度区带离心法。构成几条不同的区带，这就是等密度区带离心法。 等密度区带离心法等密度区带离心法此方法适用于分别大小相近而密度不同的样品。此方法适用于分别大小相近而密度不同的样品。优点：优点：a. a. 分别效果好，可一次获得较纯颗粒。分别效果好，可一次获得较纯颗粒。 b. b. 顺应范围广顺应范围广, ,能象差速离心法一样分别具有沉能象差速离心法一样分别具

9、有沉降降 系数差的颗粒系数差的颗粒, ,又能分别有一定浮力密度差的又能分别有一定浮力密度差的颗粒。颗粒。 c. c. 颗粒不会挤压变形。颗粒不会挤压变形。缺陷：缺陷：a.a.离心时间较长；离心时间较长； b. b.需求制备梯度；操作严厉，不易掌握。需求制备梯度；操作严厉，不易掌握。 密度梯度区带离心法密度梯度区带离心法(density gradient centrifugation)(density gradient centrifugation)三、核酸的鉴定三、核酸的鉴定核核 酸酸 核苷酸核苷酸 磷磷 酸酸 碱碱 基基 戊戊 糖糖 v定糖法戊糖的差别定糖法戊糖的差别1 1核糖核酸的鉴定核糖

10、核酸的鉴定HCCHCOCHOHCHCCHCOCHOHCOHCH3HO D核糖 糠醛糠醛 糠醛糠醛 3，5二羟基甲苯二羟基甲苯 绿色化合物绿色化合物 RNA水解水解 D核糖核糖HCCHCOHCCH3OOHCCH3地衣酚法地衣酚法: : CHOCCH2OHOHHC OHHC OHH2脱氧核糖核酸的鉴定脱氧核糖核酸的鉴定 DNA水解水解 D脱氧核糖脱氧核糖CH2CHOHCHOHCH2OHCHOCH2CH2CCH2OHCHOONH脱氧核糖脱氧核糖 羟基羟基酮基戊醛酮基戊醛二苯胺法二苯胺法: : 1分别细胞质与细胞核分别细胞质与细胞核1分别细胞质与细胞核分别细胞质与细胞核2 核酸的鉴定核酸的鉴定 实实

11、验验 流流 程程 图图 0.5g肝组织肝组织 少许石英砂研磨少许石英砂研磨加加5ml的的1.5%柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤 肝匀浆，倾入离心管肝匀浆，倾入离心管离心：离心：3000r/min；10上层液上层液沉淀沉淀参与参与1ml 0.25mol/L 蔗糖柠檬酸溶液蔗糖柠檬酸溶液 核悬液核悬液沿壁缓铺于沿壁缓铺于8ml 0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上蔗糖柠檬酸液面上离心：离心：2000r/min；5上层液弃去上层液弃去沉淀沉淀核洗液核洗液5ml洗涤沉淀，离心：洗涤沉淀，离心：2000r/min，5 上层液弃去上层液弃去沉沉 淀淀初步纯化的细胞核初步纯化的细

12、胞核 5ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核溶解细胞核待测样品待测样品鉴定鉴定地衣酚法二苯胺法 编编 号号12细胞质（滴）细胞质（滴）20-核液（滴）核液（滴）-201mol/LKOH（滴）（滴）20202鉴定：取试管三支，编号，按下表操作鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 编号编号123细胞质水解液（滴）细胞质水解液（滴）20-核液水解液（滴）核液水解液（滴）-20-5三氯醋酸（滴）三氯醋酸（滴）1010303,5一二羟基甲苯液（滴）一二羟基甲苯液（滴）3030301.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：水解：取离心管二支，编号，按下表操作：2 核糖核酸的鉴定核糖核酸的鉴定混合各

13、管混合各管沸水浴沸水浴(10)冷却冷却参与参与5%三氯三氯醋酸醋酸 (8ml)搅匀后离心搅匀后离心 2000r/min；5上清液上清液 立刻混合各管立刻混合各管沸水浴沸水浴(10)冷却冷却比较各管颜色比较各管颜色 2鉴定：取试管三支，编号，按下表操作鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:1.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：水解：取离心管二支，编号，按下表操作：编号编号12细胞质（滴）细胞质（滴）20-核液（滴）核液（滴）-201mol/L过氯酸过氯酸(滴）滴）2020 编号编号123细胞质水解液（滴）细胞质水解液（滴）20-核水解液（滴）核水解液（滴）-20-1mol/L过氯酸（滴）过氯酸

14、（滴）20二苯胺试剂（滴）二苯胺试剂（滴）202020混合各管混合各管冷却冷却离心离心 上清液上清液 立刻混合各管立刻混合各管冷却冷却比较各管颜色比较各管颜色 2000r/min;53脱氧核糖核酸的鉴定脱氧核糖核酸的鉴定表表1.核糖核酸的鉴定核糖核酸的鉴定试管编号试管编号123现象现象试管编号试管编号123现象现象表表2.脱氧核糖核酸的鉴定脱氧核糖核酸的鉴定1规范操作，防止滴管、试剂的污染。规范操作，防止滴管、试剂的污染。细核悬液的平铺要轻柔；细核悬液的平铺要轻柔；浓酸的取用要小心；试剂为浓酸配制，留意平安；浓酸的取用要小心；试剂为浓酸配制，留意平安；运用离心机留意平衡，转速从低到高；运用离心

15、机留意平衡，转速从低到高；清洗滴管。清洗滴管。思思 考考1. 本实验终了后假想象继续测定肝脏中本实验终了后假想象继续测定肝脏中DNA、RNA的含的含 量，可用什么方法？量，可用什么方法？ 2. 我们曾经学习了电泳法和层析法来分别蛋白质，请问我们曾经学习了电泳法和层析法来分别蛋白质，请问 我们能否可以用这两种方法分别我们能否可以用这两种方法分别DNA、RNA？假设能，？假设能，请简单表达其原理。请简单表达其原理。实验七实验七 血糖测定葡萄糖氧化酶血糖测定葡萄糖氧化酶-过氧化物酶过氧化物酶法及肾上腺素对血糖浓度的影响法及肾上腺素对血糖浓度的影响1.血糖的来源与去路？血糖的来源与去路？2.激素对血糖

16、的调理？激素对血糖的调理？3.什么是高血糖、低血糖，尿糖？什么是高血糖、低血糖，尿糖？4.实验原理及操作步骤。实验原理及操作步骤。下次实验预习内容下次实验预习内容生物化学设计性实验安排生物化学设计性实验安排经讨论决议，本学期第八次实验是设计性实验，也作为实验经讨论决议，本学期第八次实验是设计性实验，也作为实验考核内容，占实验总成果的考核内容，占实验总成果的30%共共9分。分。一一.内容：牛血洁白蛋白的提取与鉴定内容：牛血洁白蛋白的提取与鉴定二二.设计方案的要求和时间：设计方案的要求和时间：要求每大组要求每大组1份，写明实验目的、实验原理、操作步骤或流程、份，写明实验目的、实验原理、操作步骤或流程、仪器和试剂、预测结果、参考文献或资料等工程。于第七次仪器和试剂、预测结果、参考文献或资料等工程。于第七次实验前完成，第七次实验时交给相应实验室的实验教师。实验前完成，第七次实验时交给相应实验室的实验教师。实验设计成果实验设计成果4分科学合理分科学合理3分、可操作性分、可操作性1分分三三.实验实施的时间和要求：