植物表达载体构建

1、植物表达载体构建张玉刚 载体 vector表达载体载体克隆载体原核表达载体真核表达载体植物表达载体w质粒图谱及质粒构建质粒图谱及质粒构建启动子启动子 外源基因外源基因 终止子终止子 启动子启动子 报告基因报告基因 终止子终止子 （标记基因）（标记基因） 目的片段目的片段 选择标记选择标记 载体载体表达载体(expressing vector)n特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA序列n大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号n启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子n核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起

2、始密码子(ATG)和SD序列n转录终止序列在植物表达载体在植物表达载体Ti质粒的结构：质粒的结构：侵染植物的土壤农杆菌中带有侵染植物的土壤农杆菌中带有Ti质粒，侵染植质粒，侵染植物后会产生冠瘿瘤。物后会产生冠瘿瘤。Ti质粒上有一段质粒上有一段transfer-DNA,长为长为12-24kb，能转移并整合到植物基因，能转移并整合到植物基因组中。组中。Vir gene复制起始位点冠瘿碱代谢基因右边界(25bp)左边界生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成基因Vir基因产物可诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链线性拷贝，在其他如VIR D2,VIR D4, VIR B等蛋白的协助下，穿越农杆菌及植物细胞

3、的细胞壁、膜等，最后整合到染色体中。T-DNA的左右边界各有的左右边界各有25bp的重复序的重复序列，但右边界对列，但右边界对T-DNA的整合更为重的整合更为重要。有一些早期的植物转化载体并不要。有一些早期的植物转化载体并不含有左边界。含有左边界。T-DNA区域的大部分基因只有在区域的大部分基因只有在T-DNA插入到植物基因组后才表达，表插入到植物基因组后才表达，表达产物与冠瘿瘤的形成有关。达产物与冠瘿瘤的形成有关。Ti质粒作为转基因载体的缺陷：-转化后会产生植物激素，阻碍转化细胞的再生；-冠瘿碱合成基因对转基因植物意义不大；-Ti质粒长约200-800kb,过于庞大；-Ti质粒不能在大肠杆菌

4、中复制。 双元载体不带有vir基因，但带有大肠杆菌及土壤农杆菌的复制起始位点。所有基因操作可以在大肠杆菌中完成，之后转入一种经修饰后的Ti质粒农杆菌中，该Ti质粒包含一整套vir,但缺失T-DNA序列而无法转移，这样可提供仅vir基因产物帮助双元载体转移。 共整合载体共整合载体已很少用。外源基因首先克隆到一已很少用。外源基因首先克隆到一个克隆载体上，该载体含有一段与个克隆载体上，该载体含有一段与缺失缺失T-DNAT-DNA的的TiTi质粒有同源序列。质粒有同源序列。当该载体进入土壤农杆菌后，与当该载体进入土壤农杆菌后，与TiTi质粒整合，然后由质粒整合，然后由TiTi质粒提供质粒提供T-T-D

5、NADNA向植物细胞转移的向植物细胞转移的virvir基因产物。基因产物。病毒衍生载体病毒衍生载体比较小，易侵染植物并大量扩比较小，易侵染植物并大量扩增，可大量表达蛋白，但一般增，可大量表达蛋白，但一般难于整合到植物基因组中。难于整合到植物基因组中。 启动子启动子35S, Nos, others蛋白质定位：蛋白质定位：GFP融合蛋白，融合蛋白， GUS融合蛋白融合蛋白基因表达：启动子基因表达：启动子-GUS（蛋白）（蛋白）, 启启动子动子-GFP（蛋白）。（蛋白）。启动子的种类n组成型启动子n诱导型启动子n组织特异型启动子在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性Constit

6、utive promotern在该类型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平下，在不同组织部位表达水平没有明显差异。n特点：表达具持续性；tRNA和蛋白质表达量相对恒定；它们不表现时空特异性；不受外界因素的诱导；从结构上看，大多数组成型启动子转录起始位点上游几百个核苷酸处，存在有六聚体花纹（hexamer motifs)序列TGACTG。它们以重复形式出现并被6-8个核苷酸隔开，缺失及点突变分析表明六聚体花纹的存在对维持启动子的转录活性是必要的。CaMV 35S启动子n来自花椰菜花叶病毒，由于启动整个CaMV基因组的一小段重叠序列转录产物的沉降系数为35S，故将编码该转录产物的启动子称

7、之为35S启动子。n该启动子包括TATA盒、CAAT盒、倒转重复序列和增强子核心序列（GTGG/TTTG）。n35S可以划分为两个区域： A区：-90+8 主要负责在胚根、胚乳的根及根组织内表达； B区：-343-90 主要控制胚的子叶及成熟植株的叶组织及维管组织内表达。B区内的增强子序列可以提高表达水平，如果35S启动子中存在两个B区将能使35S启动子的活性提高10倍， 并对异源启动子也有作用。n-75处 TGACGT核苷酸的重复的花纹结构对启动子表达能力有作用，如果其突变，将引起核因子与其结合力下降，导致启动子表达能力减弱。nCaMV35S启动子加上来自AMV的一段44bp的引导序列，可使

8、其表达强度增加5倍（44bp序列是翻译增强序列）。n将加倍的CaMV35S启动子与AMV引导序列结合构成一个复合串联启动子，比未修饰的启动子表达增强20倍。Tissue specific promotern在这些启动子调控下，基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并通常表现出发育调节的特性。n这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在基础。与诱导型启动子有一定的共同点。n马铃薯块茎特异蛋白基因启动子n小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（ADPG-lucose pyrphosphorylase)启动子n番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalac

9、turnase)启动子n花粉特异表达基因启动子（lat 52）n木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因(pal)启动子Inducible promotern在某些特定的物理或化学信号的刺激下，此种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，因此，称为诱导型调节序列。共同特点n启动子的活化受到物理或化学信号的诱导；n启动子的分子结构都具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构；n感受特异性诱导的序列都有明显的专一性；n一部分该类型的启动子同时具有组织特异性表达的特点；n该类启动子常以诱导信号命名，可分为光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达启动子和共生细菌诱导表

10、达基因启动子。三种类型nA型：可以被植物体内合成的某些产物包括ABA、生长素、赤霉素以及创伤诱发产生的系统素所诱导；nB型：在高温、低温、水淹以及土壤中高浓度的盐以及重金属离子等环境因子的作用下可被诱导；nC型：一类能够对人工合成的化学诱导物，诸如四环素、地塞米松等作出反应。光诱导启动子n核酮糖二磷酸羧化酶小亚基（SSrbc)基因和光扑获复合物a/b结合蛋白（light harvesting complex protein a/b, LHCP a/b)基因。n这两个基因均由核基因编码，并在胞浆内合成含有信号肽的前体蛋白，最终输入到叶绿体发挥生物学功能。热诱导启动子n当植物暴露在高温下（通常35

11、以上）或称热休克时，植物就会在1-3小时内暂时合成一些蛋白质或增大特异蛋白质的合成量，这些诱导下合成的蛋白质成为热休克蛋白。n热激基因的结构分析：这些基因的5 端有一段保守的热激共有序列，也称为热休克因子序列（HSE）。其含有热诱导基因表达的调控序列。植物基因工程常用的报告基因植物基因工程常用的报告基因n指其编码产物能够被快速地测定、常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 作为报告基因的条件n在转化的寄主细胞中应不存在相应的内源等位基因的活性，n其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而且还应具有快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。报告基因n1

12、、绿色荧光蛋白基因n（GFP green fluorescence protein ）n2、B-葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因b-D-glucuronidase ）n3、荧光素酶基因（LUC fire fly luciferase ）n4、氯霉素乙酰转移酶基因（CAT基因）n5、抗生素基因Jellyfish Aequorea victoria: one of the oldest species on the earth Green Fluorescent Protein (GFP) This is a stereo view of GFP generated from the Brookhav

13、en Database using RIf you have the Chyou may follow the links to see GFP in action!Last updated (c) 1997 RWZELLERnGUS酶的底物是无色的酶的底物是无色的X-葡萄糖苷酸（葡萄糖苷酸（X-glucuronide, X-gluc)nGUS酶的显色反应以底物不同而不同：酶的显色反应以底物不同而不同： 5-bromo-4-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 靛蓝靛蓝 5-bromo-6-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 橘红橘红 4-

14、methylumbelliferyl-B-D-glucuronide 荧光产物荧光产物B-glucuronidase(GUS)检测方法n用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷n组织化学染色定位法n荧光法测定GUS活性n分光光度法测定GUS活性组织化学染色定位法n该方法是将底物进入被测的植物组织。n将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质。n初始产物并不带有颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作

15、用形成5，5-二溴-4，4-二氯靛蓝染料，使具有Gus活性的部位或位点呈现蓝色。n注意：在测定时，由于植物体内的过氧化物酶能促进氧化二聚作用，使颜色加深，所以染色程度不能准确反映Gus活性，Figure 1 a) Mature cold stored potato tubers, transformed and control, stained for GUS activity. b) In vitro-grown microtubers, transformed and control, stained for GUS activityTransgenic Arabidopsis stain

16、ed for GUS activity showing promoter activity of A)the constitutive promoter CaMV35S and B)B) the PsMTA promoter from pea nPattern of atao1 activity visualised by GUS expression following infection with either H. schachtii or M. incognita. Left The atao1 promoter drives GUS expression at the boundar

17、y of the symcytium of H. schachtii (n). Right In a gall induced by M. incognita (n) the disrupted vasculature shows strong expression of GUS driven by atao1 (gc, giant cells). nLeft, Down regulation of CaMV35S promoter in the syncytium of Heterodera schachtii monitored by expression of GFP (top). By

18、 comparison an unifected root shows regular GFP expression (bottom). Right, Image analysis of the mean red component of fluorescent images of a GFP-transformed Arabidopsis root, viewed under fluorescent conditions. green box = mean green level inside the syncytium; blue box = mean green level outsid

19、e the syncytium. 荧光素酶基因（荧光素酶基因（LUC）n1986年以来，荧光素酶基因被广泛地用作植物基因工程研究的一种新的报告基因.n最常用的是来自荧火虫的荧光素酶。n分子量为60.7 KD 的单体蛋白质多肽，共有550个氨基酸，它编码的基因luc已经被克隆；n在转染的细胞中，荧光素酶蛋白质的半衰期比较短，其适用于做瞬时分析。荧光素酶活性测定n先用去污剂处理细胞使之裂解，然后加入ATP、Mg2+离子和荧火虫的荧光素，于是在有氧的条件下，荧光素酶会催化荧光素进行氧化反应，产生出AMP、CO2和黄-绿色的光。利用发光计对荧光素酶反应作出定量测定。氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移

20、酶基因（CAT基因）基因）n氯霉素乙酰转移酶的编码基因cat，是位于大肠杆菌转座子Tn9上的一种抗药基因。它在真核细胞中并不存在，这一特性使其成为真核生物表达调控研究中最早使用的报告基因之一。以以 SB401 cDNA 为探针筛选马铃薯基因组文库为探针筛选马铃薯基因组文库阳性克隆绘制酶切图谱、亚克隆阳性克隆绘制酶切图谱、亚克隆构建测序载体、测序、序列分析构建测序载体、测序、序列分析启动子与报告基因连接、转启动子与报告基因连接、转化，研究启动子的特异性化，研究启动子的特异性启动子缺失确定活性区启动子缺失确定活性区技术路线技术路线与其它启动子进行活性比较与其它启动子进行活性比较花粉特异启动子的克隆

21、花粉特异启动子的克隆1pG70112000bp阳性克隆pG701质粒构建图XbaISacISacIEcoRIHindIIIBamHIBamHI1、pGEM-7Z/SacI2、pG701/SacI3、 701/SacI4、 DNA/H3kb9kbpG701酶切鉴定酶切鉴定pG701酶切电泳图酶切电泳图1 BamHI2 EcoRI3 HindIII4 SacI5 B+S6 H+S7 E+S8 B+E9 B+H10 E+H11E+B+H12 pGSB/H13 pGEM-7Zf(+)/S M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213pG701酶切酶切southern杂交杂交1 BamHI2

22、 EcoRI3 HindIII4 SacI5 B+S6 H+S7 E+S8 B+E9 B+H10 E+H11E+B+H12 pGSB/H13 pGEM-7Zf(+)/S1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 Restriction enzyme map of the insert fragment of pG70119000restriction map900bp5-3HBEBXSXBHEXSHEHB-BamHI E-EcoRI H-HindIII S-SacI X-XbaI转基因烟草萌发花粉的转基因烟草萌发花粉的GFPGFP观察观察1-14CK-光学显微镜光学显微镜CK-荧光显

23、微镜荧光显微镜转基因烟草的冰冻切片的荧光显微镜观察转基因烟草的冰冻切片的荧光显微镜观察根根叶叶CK-P3SBgLR gene promoter deletionsATG2277bp1750bp1340bp1200bp1050bp900bp732bp448bp398bp324bp300bp pBI-Del seriesNPTIIProsGUSNOSHindIIIBamHIEcoRIKpnI SacIpBI121NPTII35SGUSNOSHindIIIBamHIEcoRIKpnI SacI启动子缺失片段与启动子缺失片段与GUSGUS相连构建双元载体相连构建双元载体35S35S启动子与启动子与GU

24、SGUS相连构建双元载体相连构建双元载体(7个）个）pKLATGNPTIILAT52GUSNOSHindIIIBamHIEcoRIKpnI SacIp19ZGNPTII19ZGUSNOSHindIIIBamHIEcoRIKpnI SacILAT52LAT52启动子与启动子与GUSGUS相连构建双元载体相连构建双元载体19Z19Z启动子与启动子与GUSGUS相连构建双元载体相连构建双元载体转转GUS基因烟草抗性苗基因烟草抗性苗转转GUS基因烟草苗及植株基因烟草苗及植株转基因烟草转基因烟草GUS组织化学染色（组织化学染色（1）LAT52CK-4-51-4萌发花粉的萌发花粉的GUS 组组织化学染色（

25、织化学染色（2）LAT52-2CK-4-9GUS基因GUGUS基因组织化学染色（基因组织化学染色（3）35S-7茎横切茎横切2-2茎横切茎横切转基因烟草转基因烟草GUS酶活性检测酶活性检测012345671234567891011 LAT PB1 PB2 PB3 PB4 PB5 PB6 PB7 19Z 35S CK-表达载体构建nDNA分子的体外连接（DNA连接酶）n 粘性末端连接 连接效率高n相同酶切末端n平端连接 连接效率低1. 限制性内切酶限制性内切酶从商品目录上得到有关信息从商品目录上得到有关信息GAATTCCTTAAGEcoR IGCTTAA5p5pCTGCAGGACGTCPst ICTGCAG5p5p3OH3OH3OH3OH注意：不同公司的酶，其缓冲液有时是不同的；注意