福林酚测蛋白质 (1)

1、 学习测定蛋白质浓度的学习测定蛋白质浓度的原理和方法原理和方法 熟练熟练分光光度计，微量移液器分光光度计，微量移液器的操作以及的操作以及标标准曲线准曲线的制作的制作 第一步第一步双缩脲反应双缩脲反应（蛋白质与碱性铜试剂反应）（蛋白质与碱性铜试剂反应） 在碱性条件下蛋白质的肽键与在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质螯合，形成蛋白质-铜复合物铜复合物 第二步第二步与福林与福林- -酚试剂反应酚试剂反应在碱性条件下在碱性条件下 ，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原福林酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，生成钨蓝和钼蓝很容易还原福林酚试剂中的

2、磷钨酸和磷钼酸，生成钨蓝和钼蓝的混合物，呈蓝色。的混合物，呈蓝色。可利用分光光度计测得可利用分光光度计测得650nm650nm的的ODOD值，浓度大小跟值，浓度大小跟ODOD值成值成正比正比y=y=kx+bkx+b ODOD值是值是optical densityoptical density（光密度）：（光密度）： 入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值制作标准曲线：制作标准曲线：(1）选择标准蛋白溶液(牛血清白蛋白），配制一定浓度母液(2) 配制标准溶液浓度梯度，测定对应的OD值 (3）根据浓度和OD值得回归方程即标准曲线 利用excele软件 如何

3、制作？ 如何评估？x1y1x2y2x3y3.Xnyny=y=kx+bkx+b 0123456789101112250 g 250 g /ml/ml牛血牛血清白蛋清白蛋白（白（mlml） 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.0待测待测样品样品 1.0待测待测样品样品 水（水（mlml） 1.00.80.80.60.60.40.40.20.20000碱性铜碱性铜（mlml） 5555555555555摇匀，放置10minFolin试剂(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5迅速摇匀，室温放置迅速摇匀，室温放置2020分钟，

4、测分钟，测650nm OD650nm OD值值 以以0 0号管为空白对照，在分光光度计上以波长号管为空白对照，在分光光度计上以波长650nm650nm比色，读取光密比色，读取光密度度 值（值（ODOD值），标准蛋白含量值），标准蛋白含量g g （或者标准蛋白浓度）作为横坐标，（或者标准蛋白浓度）作为横坐标，ODOD 值作为纵坐标，制作标准曲线写出回归方程，根据待测样品值作为纵坐标，制作标准曲线写出回归方程，根据待测样品ODOD值计算蛋值计算蛋 白质含量。白质含量。 注意事项：注意事项： 及时做好标记及时做好标记 加入试剂后应立即混匀加入试剂后应立即混匀 测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内

5、测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内分光光度计的使用方法分光光度计的使用方法 设置波长设置波长 设置样品池个数设置样品池个数 调零调零 测定测定开启机器，调节所需的波长，设置样品池个数开启机器，调节所需的波长，设置样品池个数空白对照管调零（一定放在离自己最近的那个样品池）空白对照管调零（一定放在离自己最近的那个样品池）将待测样品液放入比色皿（将待测样品液放入比色皿（2/32/3高度），并将比色皿放入样品池内，盖好盖高度），并将比色皿放入样品池内，盖好盖子，测光密度值（子，测光密度值（ODOD值），按上下键翻看其他样品池的数据值），按上下键翻看其他样品池的数据测量完毕，一定把比色杯用自来水和

6、蒸馏水重新洗净，倒置于滤纸上晾干测量完毕，一定把比色杯用自来水和蒸馏水重新洗净，倒置于滤纸上晾干比色皿有光面和毛面，勿用手触摸光面，使用时光面对准光路。装液体时，需达到比色皿2/3左右；若液体不慎溢出，需用纸巾吸干，仪器如果沾有液体，请迅速擦干。注意事项注意事项微量移液器的使用微量移液器的使用 原理 微量移液器是根据“虎克定律”设计的，“在一定限度内弹簧伸展的长度与弹力成正比”：也就是微量加样器吸入液体的容量与加样器内的弹簧拉伸长度成正比。 常见种类 0.510l 550l 10100l 20200l (读数窗显示20200, 每转1档1l) 1001000l(读数窗显示1001000, 每转

7、1档为 5l)1：选择量程 根据转移液体的量，选择正确量程的微量移液器2：调节吸量体积： 将微量移液器调至所需体积，千万不要将读数的调节超出最大值和最小值；操作步骤操作步骤 3 3：吸量：吸量用移液器的吸杆插上合适的吸头，旋紧。握紧微量移液器，用大拇指按至第一档，将吸头插入溶液中。然后松开大拇指，慢慢释放按钮以吸取液体（否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部）；然后将微量移液器移出液面。释放液体时，枪头接触在容器壁上，先慢慢按至第一档，停留12秒后，再按至第二档以排出所有液体。操作步骤操作步骤4. 更换吸头： 吸取不同的液体，一定要更换枪头，防止试剂交叉污染，更换枪头时，对着废弃桶，轻轻按下卸载吸头的弹射器，吸头自然脱落在废弃桶内。5. 微量移液器的放置： 实验完毕后，将移液器调回到接近最大量程，使弹簧处于松弛状态，放到或者悬挂在架子上。操作步骤操作步骤1. 吸取不同的液体时，切记要更换吸头，2. 调节移液器时，动作要轻缓，千万不要将读数的调节超出最大值和最小值，否则会造成损坏。3. 吸取液体时，动作要轻缓，防止液体随着气流进入移液器的上部；4. 带有残余液体吸嘴的移液器不能平放。5. 每次实验完毕后将微量移液器调