分子生物学实验指导

1、分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 二oo九年十二月目 录 实验 总rna的提取、定量与rt-pcr 1 实验 质粒dna的提取、定量与酶切鉴定7 实验 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳13 附录 相关试剂盒说明书19 附录 相关仪器使用说明书 19 实验九 总rna的提取、定量与rt-pcr 一、总rna的提取与定量 目的： 从细胞中分离rna是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取rna的质量是进行其它实验的基础，如northern杂交，目的基因cdna的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理： 在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5g rna，其

2、中rrna占总量的80%-85%，trna和核内小分子rna占10-15%，而mrna只占1-5%。rrna由28s、18s、5s等几类组成，这些rna分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mrna分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mrna分子（除血红蛋白、有些组蛋白mrna以外），在3端存在20-250个多聚腺苷酸(polya)。利用此特点，用oligo(dt)亲和层析柱分离mrna。 rna分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶k-细胞质rna提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前

3、常用的是trizol法。 trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离rna。trizol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制rna酶活性，因此trizol中还加入了8羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源rnase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，rna选择性地进入无dna和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收rna；用乙醇沉淀中间层可回收dna；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 trizol试剂可用于小量样品（50100mg组

4、织、5×106细胞）也适用于大量样品（1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总rna无蛋白质和dna污染，可用于northern blot，dot blot，ploya筛选，体外翻译，rnase保护分析和分子克隆。在用于rt-pcr时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无rnase的dnase处理rna样品，避免出现假阳性。共纯化的dna可用作标准，比较不同样品rna的得率，也可用于pcr和酶切。蛋白质可用于western blotting。 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时

5、，1od值相当于双链dna浓度为50g/ml，单链dna和rna浓度为40g/ml，单链寡核苷酸的含量为33g/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的od值的比值（od260/od280），估计核酸的纯度。纯净dna的比值为1.8, rna为2.0。若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。 仪器和主要试剂： 1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄pcr反应管 2. trizol试剂 3. 氯仿 4. 异丙醇 5. 75

6、乙醇6. 无rnase的水或0.5sds (溶液均需用depc处理过的水配制) 实验方法：本次实验采用takara 公司的rnaiso plus试剂 （一）rna提取 1. 匀浆处理: a.组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml trizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过trizol体积10。 b.单层培养细胞 直接在培养板中加入trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。trizol加量不足可能导致提取的rna有dna污染。 c.细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物

7、、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml trizol，反复吸打。加trizol之前不要洗涤细胞以免mrna降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量rna的前提；细胞数量与trizol的比例，细胞的数量不能过多。) 2. 将匀浆样品在室温（15-30）放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8 10000×g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量dna，上清中含有rna。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去

8、除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。 4. 每使用1ml trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3 min。 (注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。) 5. 2-810000×g离心15 min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。rna主要在水相中，水相体积约为所用trizol试剂的60。 6. 把水相转移到新管中（如要分离dna和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的rna。每使用1ml trizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10 min。 7. 2-810000g离心10 min，离心前看不出rna沉淀，离心

9、后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 8. 用75乙醇洗涤rna沉淀。每使用1ml trizol至少加1ml 75乙醇。2-8不超过7500g离心5 min，弃上清。 9. 室温放置干燥或真空抽干rna沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min。加入25-200l无rnase的水，-70保存。 （二）紫外吸收检测rna的浓度和纯度 2 1. 紫外分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。 2. 取rna样品2l，用水稀释50倍，转入分光光度计的石英比色杯中。 3. 在260nm和280nm分别读出样品od值。根据260nm时1 od单位的单链rna = 40g/ml

10、和稀释倍数，可以计算出样品rna的浓度和产量。 4. 若od260/od280小于2，说明可能有dna片段污染，可以考虑用无rnase的dnase处理样品，若小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化rna。 注意事项： 1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取rna是可加入少许糖原以促进rna沉淀。例如加1ml trizol匀浆样品，沉淀rna前加5-10g rnase-free糖原。糖原会与rna一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响pcr反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可在-60-70保存至少一个

11、月。rna沉淀可保存在75%酒精中2-8一个星期以上或-5-20一年以上。 3. 预期产量：1mg组织或1×106细胞提取rna分别为： 肝和脾6-10 g，肾3-4 g，骨骼肌和脑组织1-1.5 g，胎盘1-4 g，上皮细胞8-15 g，成纤维细胞5-7 g。 4. 蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀rna的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1ml trizol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8mol/l柠檬酸钠和1.2mol/l nacl)混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯rna。从含有大量多糖的植物中提取r

12、na时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。 5. 预防rnase污染措施： 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为rnase的来源。 使用灭过菌的rna专用塑料制品避免交叉污染。 rna在trizol试剂中时不会被rnase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含rnase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料制品可在0.5mol/l naoh中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除rnase。 配制溶液应使用无rnase的水（将水加入处理过不含rnase的玻璃瓶中，加入depc至终浓度0.01v/v，放置过夜，高压灭菌。注：depc有致癌之嫌，需小心操作。

13、rna的提取常见问题分析 问 题 解 析 得率低 a样品裂解或匀浆处理不彻底 brna沉淀未完全溶解 a260/a280<1.65 a检测吸光度时，rna样品没有溶于水，而溶于了te中 二、逆转录-聚合酶链反应 (reverse transcription-polymerase chain reaction，rt-pcr) 原理： 提取组织或细胞中的总rna，以其中的mrna作为模板，采用oligo（dt）或随机引物利用逆转录酶反转录成cdna。再以cdna为模板进行pcr扩增，而获得目的基因或检测基因表达。rt-pcr使rna检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量rna样品分析成

14、为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cdna探针、构建rna高效转录系统。 (一) 反转录酶的选择 1 money 鼠白血病病毒（mmlv）反转录酶：有强的聚合酶活性，rna酶h活性相对较弱。最适作用温度为37。 2 禽成髓细胞瘤病毒（amv）反转录酶：有强的聚合酶活性和rna酶h活性。最适作用温度为42。 3thermus thermophilus、thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在mn2+存在下，允许高温反转录rna，以消除rna模板的二级结构。 4mmlv反转录酶的rnase h-突变体：商品名为superscript 和supers

15、cript。此种酶较其它酶能多将更大部分的rna转换成cdna，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mrna模板合成较长cdna。 (二) 合成cdna引物的选择 1随机六聚体引物：当特定mrna由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mrna。用此种方法时，体系中所有rna分子全部充当了cdna第一链模板，pcr引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cdna中96%来源于rrna。 2 oligo(dt)：是一种对mrna特异的方法。因绝大多数真核细胞mrna具有3端poly(a+)尾，此引物与其配对，仅mr

16、na可被转录。由于poly(a+)rna仅占总rna的1-4%，故此种引物合成的cdna比随机六聚体作为引物和得到的cdna在数量和复杂性方面均要小。 3特异性引物：最特异的引发方法是用含目标rna的互补序列的寡核苷酸作为引物，若pcr反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mrna 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cdna，导致更为特异的pcr扩增。 仪器和主要试剂： 1. 基因扩增仪(如pe geneamp pcr system 2400 或 9700)、微量加样枪、凝胶成像系统、灭菌超薄pcr反应管 2rna提取试剂 3第一链cdna合成试剂盒4dntp mix：含d

17、atp、dctp、dgtp、dttp各2 mmol/l5taq dna聚合酶 实验方法：本次实验采用takara 公司的primescript rt reagent kit 1. 总rna的提取：见前述内容。 2. cdna第一链的合成：目前试剂公司有多种cdna第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以takara公司提供的primescripttm 1st strand cdna synthesis kit试剂盒为例。 （1）在0.2ml微量离心管中，加入以下： 总rna 1-5 g 、dntp 1 l 、random primer 1 l 、补充适量的depc h2o使总体积

18、达10 l。轻轻混匀、离心。 （2）pcr仪上65加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 （3）然后加入下列试剂的混合物： 5×primescript buffer 4 l 、rnase inhibator 0.5 l 、rtase 1 l 、rnase free h2o 4.5 l ，轻轻混匀，离心. （4） 30孵育10 min。 （5） 42孵育60 min。 （6）于70加热15 min以终止反应，将管插入冰中。 3pcr：本次实验采用premix taq version2.0(loading dye mix)试剂 （1）取0.5ml pcr管，依次加入下列试

19、剂：第一链cdna 2 l 、上游引物（10pmol/l）2 l 、下游引物（10pmol/l）2 l 、dntp(2mmol/l) 4 l 、10×pcr buffer 5 l 、taq酶（2u/l） 1 l 。（2）加入适量的ddh2o，使总体积达50 l。轻轻混匀，离心。 （3）设定pcr程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在pcr扩增目的基因时，加入一对内参（如g-3-pd）的特异性引物，同时扩增内参dna，作为对照。 （4）电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 （5）结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。

20、注意事项： 1 在实验过程中要防止rna的降解，保持rna的完整性。在总rna的提取过程中，注意避免mrna的断裂。 2 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 3 内参的设定：主要为了用于靶rna的定量。常用的内参有g-3-pd（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、-actin（-肌动蛋白）等。其目的在于避免rna定量误差、加样误差以及各pcr反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 4 pcr不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标dna起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。 5 防止dna的污染： （1）采

21、用dna酶处理rna样品。 （2）在可能的情况下，将pcr引物置于基因的不同外显子，消除基因和mrna的共线性。 附注： （1）-actin 引物序列： sense 5-accatggatgatgatatcgcc-3 、antisense 5-gtgccagattttctccatgtc-3 ，片段长度 264（71-334）； （2）目的基因gapdh引物序列 ：sense 5' atggggaaggtgaaggtcgg 3' 、antisense 5' caggggtgctaagcagttgg 3' ，片段长度：480（103-582） 。（3）实验材料：he

22、k293（人胚肾细胞） 实验 质粒dna的提取、定量与酶切鉴定 目的： 采用碱变性法，学习小规模制备质粒dna的技术；了解紫外吸收检测dna浓度与纯度的原理，掌握测定方法；学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒dna的构型、分子量的大小；学习体外构建或鉴定重组dna分子时，根据目的基因及载体选择合适的限制性内切酶；学习pcr的基本原理与实验技术，了解引物设计的一般要求。 原理： 碱变性抽提质粒dna是基于染色体dna与质粒dna的变性与复性的差异而达到分离目的。在ph值高达12.6的碱性条件下，染色体dna的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒dna的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互

23、补链不会完全分离，当以ph4.8的naac高盐缓冲液去调节其ph值至中性时，变性的质粒dna又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体dna不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体dna与不稳定的大分子rna、蛋白质sds复合物等一起沉淀下来而被除去。 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1od值相当于双链dna浓度为50g/ml，单链dna和rna浓度为40g/ml，单链寡核苷酸的含量为33g/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的od值的比值（od260/od280），估计核酸的纯度。纯净dna的比值为1.8, r

24、na为2.0。若比值高于1.8说明dna样品中的rna尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液，在测定的浓度为590g/ml范围内，该方法较为可靠，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，可作为电泳支持物，适用于分离大小范围在0.2-50kb的dna片段。dna分子的迁移率与分子量的对数值成反比关系。观察其迁移距离，与标准dna片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。在质粒抽提过程中，由于各种因素的影响，使质粒dna呈现超螺旋的共价闭合环状、开环状

25、分子、线状分子三种不同的构型，这三种分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。用荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide, eb ）进行检测，溴化乙锭嵌入碱基对之间形成荧光络合物，在紫外线激发下发出红色荧光。 限制性内切酶及其它dna修饰酶是分子生物学在dna操作时常用的工具，限制性核酸内切酶是应用最多的一类酶，它分为，型，型最常用，通常所用的限制性内切酶多指此型。型限制性内切酶是一类位点特异性酶，识别双链dna分子上特异的核苷酸序列，一般识别46个核苷酸：ecor :5-gaattc-3；bamh ： ggaatc；hind ：aa

26、gctt；msp :ccgg。不同的限制性内切酶切割双链dna的方式不同。 根据这些特性可以很容易地在体外进行dna的重组操作。一般典型的限制性内切酶反应是底物dna在含有mg2+，na+的缓冲液（如ph=7.5）中，加入限制性内切酶，在37保温。在适当条件下（包括温度，ph，离子强度），1小时内完全酶解，1g dna所需限制性内切酶的量，定义为一个活性单位。影响酶切反应的因素有：底物dna的纯度，反应系统，反应体积，时间和温度。 主要仪器： 离心机，紫外分光光度计，恒温水浴锅，水平电泳槽，电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统，基因扩增仪（pcr仪） （一）质粒dna的提取 主要试剂： 溶液i：

27、50 mmol/l 葡萄糖 、10 mmol/l edta 、25 mmol/l tris-hcl (ph 8.0) 、2毫克/毫升 溶菌酶 溶液ii： 200 mmol/l naoh 、1% sds 、溶液iii： 3 mol/l naac (ph4.8)溶液 、te缓冲液：10 mmol/l tris-hcl ,ph 7.5 、1 mmol/l edta 实验方法：本次实验采用百泰克公司的质粒小量制备试剂盒(离心柱型) 1、将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的lb液体培养基的10毫升试管里，37振培过夜，1618小时 2、转移以上菌液1.5毫升于ep管中，8000rpm离心3

28、0秒 3、小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀 4、加入溶液i 100l，盖紧ep管盖，翻转数次，冰上放置10分钟 5、加入溶液ii 200l，温和翻转ep管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟 6、加入溶液iii 150l，将ep管盖紧后来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟 7、12000rpm离心15分钟 8、将上清转移到另一个ep管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。加入等体积的酚和氯仿：异戊醇各抽提一次 9、加入1毫升预冷的无水乙醇和1/10体积naac(3 mol/l,ph5.2)，盖紧，并翻转ep管数次混匀 10 置于-20冰箱12小时 1

29、1 15000rpm离心15分钟，去除上清，收集管底白色沉淀 12 70%乙醇洗涤一次，空气干燥或真空抽干 13 将沉淀溶于50l te缓冲液或去离子水，完全溶解后，-20保存 14 取样5l，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，观察dna条带。（二）紫外吸收检测dna的浓度和纯度 主要试剂：提取的质粒dna 实验方法： 1、 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。 2、 取质粒dna样品2l，用水稀释50倍，转入分光光度计的石英比色杯中。 3、 在260nm和280nm分别读出样品od值。根据260nm时1 od单位的双链dna = 50g/ml和稀释倍数，可以计算出样品dna的浓度

30、。 4、 若od260/od280大于1.8，说明仍有rna，可以考虑用rna酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化dna。 （三）质粒dna的双酶切鉴定 主要试剂： 纯化的质粒dna(100ng/l) 、限制性内切酶(takara)： hind iii (15u/l), ecor i (12u/l) 、酶的贮存缓冲液： hind iii： ecor i 、10mm tris-hcl 10mm tris-hcl 、400mm kcl 、100mm kcl 、0.1mm edta 0.1mm edta 、1mm dtt 1mm dtt 、0.01%

31、 bsa 0.15% triton x-100、50% 甘油(ph 7.5) 0.01% bsa 、50% 甘油(ph 7.5) 、10 × buffer： 100mm tris-hcl(ph 7.5)、100mm mgcl2 、10mm dtt 、500mm nacl 、无菌去离子水 实验方法： 1、在1.5ml eppendorf管中按顺序依次加入下述试剂，混匀后即成酶切反应体系： 无菌去离子水: 11l 、10 × buffer 2l 、质粒dna 5l(共500ng)、 hind iii (15u/l) 1l 、ecor i (12u/l) 1l ，共 20l 2、

32、将反应管置37水浴13h 3、反应结束后取10l反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测并观察结果，酶切产物应为不同大小的两个片段。 （四）琼脂糖凝胶电泳 主要试剂： 提取的质粒dna，酶切产物 5×tbe：54gtris; 27.5g硼酸; edta (0.5mol/l, ph 8.0) 20ml, 加水至1l，用前稀释10倍 溴化乙锭（eb）：10mg/ml溶液 或其他核酸染料物质 溴酚蓝或加样缓冲液（loading buffer）实验方法： 1、称取1g琼脂糖于100ml 0.5×tbe中，加热溶解，冷却至65左右再加入终浓度为0.5%-1.0%的eb（或其他核酸染料物质

33、）。 2、将电泳胶模置于制胶架中，梳子置于适当位置，将冷却至65左右的琼脂糖溶液慢慢倒在胶模上，厚度约3。静置，待胶凝固后将胶模从制胶架中取出，放入电泳槽内，倒入适量电泳缓冲液（一般液面高出凝胶1），小心拔出梳子。 3、将5g提取的质粒dna样品和酶切产物，分别与溴酚蓝指示剂（或loading buffer）混匀，加入凝胶点样孔内，防止产生气泡和样品溢出。 4、将电泳槽通电，80v恒压电泳30分钟。 5、电泳完毕，关掉电泳仪，小心取出凝胶置于紫外灯下观察结果。 6结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带拍照分析，保存。 注意事项： 1、防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。

34、 2、eb是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有eb的溶液在弃置前应当进行净化处理。 附注一： 实验所用的相关材料信息 备选一 1质粒dna提取所用菌液样品 （1）宿主菌：dh5； （2）载体：pet-28a(+)； （3）插入片段基因：泛素化基因fbox（1.6kb）。 2质粒dna酶切鉴定 （1）所用的限制性内切酶：ecor i 和hind iii； （2）酶切产物：插入片段（1500bp）及载体（3800bp）。 备选二 1质粒dna提取所用菌液样品 （1）宿主菌：dh5； （2）载体：pmd18-t； （3）插入片段基因：抑癌基因chd5启动子区的一段区域（400bp

35、）。 2质粒dna酶切鉴定 （1）所用的限制性内切酶：ecor i 和hind iii； （2）酶切产物：插入片段（400bp）及载体（2.7kb）。 附注二： 质粒图谱 1. pet-28a(+) 载体 2. pmd18-t载体 附注三：质粒提取试剂盒说明书见附录 实验 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 目的： 掌握sds-page的基本原理，学会使用该方法来分析所表达的蛋白质，蛋白质大小、形状和所带电荷不同，在sds-page中的迁移率就不同，因此可采用该方法来推算所表达的蛋白质的分子量。 原理： 聚丙烯酰胺，即丙烯酰胺和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂过硫酸铵作用下聚合形成凝胶。反应液中还加有

36、四甲基乙二胺用来引发和控制聚合反应。反应液顶覆盖一层水层，保证凝胶表面平坦，同时起到隔离大气中氧气的作用，因为氧气可抑制聚合反应。 在蛋白质溶液中加入sds，这种阴离子去污剂能够与蛋白质相结合，破坏蛋白质内部、分子之间以及其他物质的非共价键，使蛋白质变性而破坏原有的空间构象。按照1.4gsds/1g蛋白质结合，形成sds-蛋白质复合物。由于sds带负电，使各种蛋白质的sds-多肽复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类的蛋白质原有的电荷差别；同时，不同蛋白质的sds复合物形状也相似，都呈长椭圆形。因此，在自由电泳时，它们的泳动率基本相同，而在某一

37、适宜浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳介质中电泳时，由于凝胶的分子筛作用，电泳迁移率就取决于蛋白质-sds复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小。 sdspage 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、ph 和凝胶孔径等所组成。 1样品的浓缩效应 在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(trisgly，ph8.3)、浓缩胶缓冲液(trishcl，ph6.8)、分离胶缓冲液(trishcl，ph8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的hcl 几乎全部解离成cl-，两槽中的gly

38、 (pi6.0，pk a=9.7)只有很少部分解离成gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。c1-速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，gly 负离子最慢(尾随离子)。由于c1-很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和gly 离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。 2分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其ph 升高(电泳进行时常超过9.0)，使gly 解离成负离子的效应增加；同时因凝

39、胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使gly 的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的ph 和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。 根据经验得知，当蛋白质分子量在11.7-165kd之间时，蛋白质-sds复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数成线性关系，符合直线方程式；lgmw=-bx+k（mw为蛋白质的分子量，x为蛋白质-sds复合物电泳的相对迁移率，k和b均为常数），将已知分子量

40、的标准蛋白质在sds-page中电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 仪器与主要试剂： 1. 主要器材： 电泳仪、垂直电泳仪、进样器、镊子、注射器、烧杯、旋涡器、离心机 2. 主要试剂： （1） 低分子量标准蛋白质液10l； （2） 菌体培养液一支1.5ml ；宿主菌：bl21；经iptg诱导表达的蛋白：f-box蛋白（泛素相关蛋白），分子量略小于50kd。 （3） 2×蛋白质样品缓冲液，组成如下： tris 0.15g 、-巯基乙醇 1.0ml 、溴酚蓝 0.02g 、甘油 2.0ml

41、 、sds 0.4g 、蒸馏水 7.0ml 。3. 试剂配制： 30%丙烯酰胺 称29g丙烯酰胺，1g甲叉丙烯酰胺，溶于蒸馏水并定容至100ml，滤纸过滤后置棕色玻璃瓶内室温保存 10%过硫酸铵 1g过硫酸铵溶于蒸馏水定容至10ml temed n，n，n，n-四甲基乙二胺，棕色瓶保存 上胶缓冲液 tris12.1g， sds0.4g溶于60ml蒸馏水，用盐酸调ph6.8，定容至100ml 下胶缓冲液 tris12.1g， sds0.4g溶于60ml蒸馏水，用盐酸调ph8.8，定容至100ml 1×甘氨酸电泳缓冲液 25mmol/l tris（3.02g），250mmol/l 甘氨酸

42、（18.8g），0.1%sds（1g），加蒸馏水至1000ml 染色液 0.5g考马斯亮蓝r250，90ml甲醇，20ml冰乙酸，加水至200ml 脱色液 与染色液成分相似，无考马斯亮蓝r250 实验方法： 1. 安装电泳槽凝胶装置 先将二块玻璃板洗干净，干燥，嵌入胶带的凹槽中，装在电极槽上，拧紧外螺丝，使其夹紧（不能过紧以防玻璃破裂），放入制胶架固定，留待灌胶。2. 凝胶的制备 由冰箱中取出储液平衡到室温后开始配胶，在50ml烧杯内按下列配方(一块胶)配制sds-page分离胶（下胶）：(此配方建议更改为现行的，与仪器装置配套的数据) sds-page配方 30%丙烯酰胺 ml 缓冲液 ml

43、 h2o ml 10%过硫酸铵l temed l 总体积 ml 下胶10% 3.3 2.6 4 100 4 10 上胶5% 0.83 0.68 3.4 50 5 5 3. 灌胶 迅速将配好的丙烯酰胺溶液（分离胶）灌入两片玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间（梳子齿长再加1厘米），用细管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖上一层蒸馏水，防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应。待分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层。 再按上表配置5%浓缩胶（上胶）立即混合，在已聚合的分离胶上直接灌注后，立即在上胶溶液中插入干净的梳子，两边平直，小心避免气泡混入，将凝胶垂直放置于室温下10-15min，待浓缩胶凝

44、固后，将梳子小心拔出，然后用水冲洗加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺，用针头把加样槽之间的胶齿弄直，将凝胶装置从制胶架中取出，放入电泳槽盒中，并在电泳槽内加入tris-甘氨酸电泳缓冲液。 4. 样品处理 （1） 待测蛋白质样品处理 经37培养过夜的大肠杆菌菌液1.5ml， 6000rpm离心10min，弃上清加入te缓冲液（0.1moltris，10mmol/l edta）50l，将菌体再旋涡器悬浮，再加入2×样品缓冲液50l混匀，在100水浴中煮沸5min。 （2） 标准蛋白质样品（蛋白质marker）的处理 将已分装好的10l标准蛋白质样品中加入10l样品缓冲液，混匀，在100水浴中煮

45、沸5min。 5. 加样 待样品冷却后，用微量进样器（或加样枪接上小吸管），吸取1030l样品，按号依次加入样品槽，因样品液内有甘油，可使样品沉降在凝胶面上。 6. 电泳 加样完毕，将上槽（黑色电极）接负极，下槽（红色电极）接正极，打开直流电源，先把电压调至8v/cm（80v），待染料前沿进入分离胶成狭窄带时，将电压提高到12v/cm（120v），电泳1.5-3h后，直到溴酚蓝指示剂迁移到接近凝胶底部时立即停止电泳。 7. 剥胶 从电泳槽上卸下凝胶板，放置在纸巾上，用刮勺（或取胶器）撬开玻璃板。 8. 染色以及脱色将电泳后的凝胶板轻轻取下，放入染色液中染色，20min1h后，把染色液倒回瓶中，

46、加入脱色液，脱色4-8h，其间更换脱色液3-4次。可将凝胶浸于水中或固定在20%甘油中或抽干，干燥后成胶片保存或拍照。 蛋白质分子量计算 电泳迁移率的计算： 按下列公式计算蛋白质样品的相对迁移率（mr） 相对迁移率（mr）=（蛋白质样品移动距离/脱色后胶长）×（染色前胶长/指示剂移动距离） 根据蛋白质迁移率按上述直线方程式即可计算出蛋白质分子量。 注意事项： 1. 丙烯酰胺时有毒试剂，操作时务必小心，切勿接触皮肤或溅入眼内，操作后注意洗手。 2. 制胶过程 封槽制备分离胶（下胶）快速倒入玻璃夹层，至短玻璃上端约3cm停止用滴管小心快速加入蒸馏水约2ml封胶分离胶凝聚后（约30min），甩干水配制浓缩胶（上胶）快速倒入插梳子浓缩胶凝聚后拔梳子（约20min）电泳槽内灌入1×甘氨酸缓冲液800ml把胶柱弄直。 3. 样品处理及电泳过程 0.5ml菌液6000rpm离心10min收集菌体弃上清加