小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定

1、发酵工程工艺原理实验报告小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定 学 校： 华南农业大学 学 院： 食品学院 班 级： XX级食品科学与工程X班 小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定摘要 为研究小型发酵罐分批培养过程中大肠杆菌的菌体生长状况，本实验以分批培养法培养大肠杆菌，通过控制发酵过程的温度、溶氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等参数，并每小时取样测DO值和还原糖量，制作菌体生长曲线，以此判断大肠杆菌的生长发酵状况。本实验选用生长迅速的大肠杆菌进行发酵罐的培养，同时定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的细菌浊度以及残留还原糖的变化。关键词 大肠杆菌 发酵前言 发

2、酵过程中，微生物的生长呈一定规律，掌握微生物生长曲线，可以防止菌种老化衰退、防止有害产物积累、提高发酵的效率，对生产有指导意义。通过测定生化指标，可大体了解菌体生长曲线，并在此基础上采取适当措施促进微生物生长。生长曲线中，微生物产生代谢产物或抗生素多在对数期末期或稳定期，因此可采取方法延长次期，如通过发酵罐等方法，不断调节培养基的pH值，去除有害物质，增加适量的气体和营养物质，使微生物延迟进入或不进入衰退期，从而生产出大量的有用的代谢产物1。发酵罐是生化、食品、医药、农药、化工等生产领域的常用设备，虽然发酵罐的类型很多,如自吸式、气升式等。但发酵工厂用得最多的还是传统的通用发酵罐(机械搅拌发酵

3、罐)2。发酵罐配备控制系统，它主要是对发酵过程中的各种参数如温度、pH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、补料、泡沫水平等进行设定、显示、记录以及对这些参数进行反馈调节控制。1材料与方法1.1实验流程：1.2菌种准备1.2.1配制培养基1) 配制种子固体培养基100mL，分装试管，0.1MPa灭菌20min，然后摆成斜面。2) 配制种子培养液600mL，分装50mL于一个250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下550mL平均分装于三个500mL三角瓶中（作二级种子用），同上灭菌。1.2.2接种与培养1) 上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37培养24h。2) 上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶

4、， 37振荡培养12h，然后转接二级种子瓶， 37振荡培养10h。1.3上罐前的准备及实罐灭菌1) 洗净发酵罐及各联接胶管2) 配制发酵培养基5.0L，置发酵罐内，加入几滴泡敌。 3) 校正pH电极和溶氧（DO）电极。 4) 把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套出、进水阀V2、W1，使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min，开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门S1，进行在位灭菌。 5) 当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时，2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时，微开阀V4适当

5、排气，并调整蒸气阀S1维持罐温。保温结束后，关蒸气阀S1，全开冷凝水出水阀V1，开进水阀W3，将温度设定在37，切入自动。6) 当温度降到100以下，缓缓开排气阀V4，使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。 7) 连接通气管路，将进气过滤器K7口与控制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通空气压缩机电源，对发酵罐进行通气，调整空气流量35L/min。 8) 当温度达到37时，将预先灭菌的pH电极、DO电极（75%酒精消毒、UV消毒）接入发酵罐，连接各电极导线。9) 将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设在15%，下限设为“0”，待一切准

6、备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。10) 设定搅拌转速为300r/min、空气流量23L/min、pH7.0、DO100%，系统进入发酵状态。 1.4发酵操作1) 当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，进行如下操作：2) 取样：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶，开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J3。3) 接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。 1.5发酵过程中

7、的管理1) 每小时记录发酵过程温度、pH、DO、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。2) 注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。(例：当在某一时段泡沫大量生成时，系统消泡不运转，可将消泡泵切入到手动加入几滴消泡剂)。3) 每小时取一次样。每次取样50mL。取样时，用量筒准确取流出的培养液50mL, 对号倒入三角瓶中，封口，立即放入冰箱保存。1.6放罐 经过发酵约10h后，菌量增长（OD）值缓慢时，便可放罐。排放液需经灭菌处理才可进入下水道。 1.7清洗放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电源。2结果与分析2.1 pH随时间变化的规律图1 不同时间发酵液的p

8、H值由图1可知，发酵过程中pH值的总趋势是先缓慢下降，待下降到最低值后，再开始迅速上升然后趋于平缓。02h延滞期的菌体生长缓慢，pH值略有下降，是因为菌体在繁殖时消耗弱碱性的葡萄糖导致pH值下降，由于菌体数量较少，其下降幅度较小；25h对数期菌体的比生长速率较高，消耗大量弱碱性的葡萄糖，导致pH值持续下降至最低值；57h稳定期的菌体数量保持不变， pH值呈现以上升速率逐渐增大的趋势上升，且整个上升阶段上升速率在稳定期末期达到最大上升速率，原因是菌体基数较大，大量的代谢产物积累，并产生碱性物质中和原有环境的酸度，导致pH值迅速上升；78h为发酵的衰亡期，pH值上升速率相比稳定期有所下降，并逐渐趋

9、于平缓，原因是细胞开始衰亡，细胞代谢进入迟缓阶段，难以产生更多的代谢物质。2.2 DO值随时间变化的规律图2 不同时间发酵液的DO值 由图2可知,DO值随着发酵时间的增加而逐渐下降直至趋于平缓，02h为菌体发酵的延滞期，DO值缓慢下降，原因是菌体数量基数不大，生长较少,消耗的溶解氧较少；25h为发酵的对数生长期，在对数生长前期，菌体比生长速率达到最大,对溶解氧的消耗也最快；57h为菌体发酵的稳定期，溶解氧含量减少量极小,原因是菌体生长处于稳定时期,对溶解氧的消耗速率略大于空气中氧的溶解速率;7h以后,溶解氧含量几乎不变,原因是菌体生长过程中对溶解氧的消耗与空气中的氧的溶解相互消长,使得溶解氧含

10、量维持在14%左右的相对平衡状态。2.3还原糖浓度S随时间变化的规律图3 不同时间发酵液的还原糖浓度 由图3可知,还原糖浓度随着发酵时间的增加而逐渐下降，02h为菌体发酵的延滞期，还原糖浓度缓慢下降，延滞期还原糖浓度下降速率差异不显著，趋势较为平缓，原因是菌体数量基数不大，消耗还原糖较少；25h为发酵的对数生长期，在对数生长前期，虽然有较高的还原糖消耗速率但总体显示下降趋势较平缓，3h后还原糖含量迅速下降；57h为菌体发酵的稳定期，前期的还原糖含量略有下降，原因是菌体总量仍在增长，随后还原糖含量基本保持不变，曲线趋于平缓。对数生长期中后期还原糖浓度下降速率较延滞期和对数生长期前期差异非常显著，

11、对数生长期菌体迅速增长对还原糖的利用较高，而到达稳定期生长较迟缓，但可能由于菌体基数较大，仍对还原糖的利用速率在一定范围内保持同一水平；而稳定期后期菌体数量达到最大值，葡萄糖几乎被菌体生长代谢逐渐消耗完毕，并且其消耗速率下降差异非常显著，原因是在稳定期后期菌体的生长受到抑制，导致葡萄糖的消耗速率相应降低。2.4 菌体生长曲线图4 不同时间发酵液的菌体浓度 由图4可知，时间为02h阶段时，发酵罐中的干菌体浓度增加速度较为缓慢，进入发酵的延滞期，该时期的物料和空间充足，但是没有达到较高的生长速率，主要原因是菌体在为生长繁殖作物料的准备；时间为25h阶段时，干菌体浓度迅速上升，其生长速率在此区间最大

12、并在4h时达到最大生长速率，进入发酵的对数生长期；时间为57h阶段时干菌体浓度达到最大值，而增长速率迅速下降最后基本恒定为零，达到发酵的稳定期，原因是随着菌体数量的增长，菌体在前期生长时消耗大量物料，受到物料和空间的限制；78h干菌体浓度开始下降，增长速率呈现负相关，进入菌体生长的衰亡期，此时菌体间竞争生长繁殖受到抑制，菌体死亡的速率大于繁殖的速率，该阶段有可能产生了影响菌体生长的代谢产物，需进一步探究。 2.5 最大比生长速率图5 菌体的最大比生长速率由软件作图可得到图5中相关性系数R²=0.9867的线性直线y = 0.6061x - 1.070，由LnX-t图中斜率的意义可知,

13、拟合线性直线的斜率即为最大比生长速率,即m=0.6061g/(g·h) 2.6 葡萄糖浓度和菌体细胞数量关系X-S图图6 菌体X-S图 由软件作图可得到图6中相关性系数R²=0.9333的线性拟合直线y =- 0.2897x + 6.3239，由X-S图中斜率的意义可知,拟合线性直线的斜率的相反数即为YX/S的数值,即YX/S=0.2897g/g3.影响发酵结果的因素3.1 pH发酵液的pH 值是影响细胞生长以及产物表达的重要参数之一. 发酵液的pH 影响大肠杆菌的生长和代谢产物的形成, 同时还影响发酵液中某些营养物的解离和中间代谢产物的解离, 从而影响大肠杆菌对营养物质的

14、吸收和利用，发酵液的pH 影响酶的活性, 使代谢和细胞透性发生变化. 如果不控制发酵液的pH,则在发酵过程中pH 会产生较大的变化, 严重影响细胞的生长和产物的表达5。3.2 Do值 菌体维持生命的呼吸作用需要消耗氧，而且微生物只能利用溶解氧。溶氧的规律性变化能够反映大肠杆菌生长的规律, 即在细菌生长的适应期细菌数量较少, 耗氧量少, 溶氧曲线最高; 随着发酵时间的增加, 细菌不断增多, 耗氧量也随之增加, 溶氧曲线下降; 达到对数生长期, 曲线最低; 进入稳定期, 曲线趋于平稳; 到发酵后期, 细菌进入衰老期, 溶氧曲线略有上升。4 菌体达到一定数量后消耗的氧气量比较稳定，所以发酵后期的氧气

15、消耗量变化不大。3.3 葡萄糖浓度在分批培养过程中,葡萄糖浓度过高或者过低都会对菌体生长繁殖产生影响。葡萄糖的浓度过高, 细菌分解代谢有害废物,乙酸会积累过多抑制细菌的生长,也会降低了外源蛋白的表达。葡萄糖浓度过低，无法满足菌体所需营养物质。分批补料就是通过限制流加碳源来控制细菌的代谢途径, 使比生长速率不致过高, 降低葡萄糖效应, 避免底物抑制作用,减少有害代谢物的大量产生, 故细菌可以稳定地生长, 在较短的时间内达到较高的生物量。33.4温度温度影响微生物酶的活性进而影响微生物代谢的速率；影响基质的溶解度从而影响溶氧的浓度等影响大肠杆菌的发酵，所以发酵过程中对温度进行了严格的控制，根据大肠

16、杆菌菌种的生长阶段结合培养条件，发酵过程将温度控制在大肠杆菌的最适合温度37。3.5通风和搅拌的剧烈程度在发酵过程中，通风和搅拌的剧烈程度影响着泡沫的形成和溶氧的浓度。若通风和搅拌程度小，会使发酵液的溶氧量下降，影响后续发酵；若通风和搅拌程度大，则易生成泡沫，而增加染菌的机会，使菌体提早自溶，导致菌体产量下降，故应严格控制通风和搅拌的程度，该实验中，通风量是23 L/min，搅拌器的转速是300r/min。4结论 最终获得的实验结果为干菌体浓度X(g/L)随时间逐渐上升，葡萄糖浓度S（g/L)随时间逐渐下降，ph随时间逐渐增加，最大比生长速率m=0.6061g/(g·h)，以葡萄糖为基准的平均细胞得率系数为YX/S=0.2897g/g.参 考 文 献1李向阳,邵卫华,刁恩杰等. 温