成都大学大学生创新性实验计划项目申请表

1、附件1项目编号 _成 都 大 学大学生创新性实验计划项目申请表项目名称：基于生物工程技术的卷叶贝母有效组分生产关键技术研究项目负责人：陈然所在学院、年级：生物产业学院生物工程07级1班联系电话子邮件：286804486指导教师：王跃华项目起止时间：起于：2000年10月止于：2012年10月填表日期：二九 年 十 月 十九日成都大学教务处制填表说明1、成都大学“大学生创新性实验计划”项目申请表由立项负责人逐项认真填写，填写内容必须实事求是，表达明确严谨，空缺项要填“无”。并用A4纸打印，于左侧装订成册。2、申请参加成都大学“大学生创新性实验计划”项目团队人数一般以23

2、人为主，最多不得超过3人。3、项目负责人填写完申请表后，必须请指导教师审核，并填写意见和签名。4、成都大学“大学生创新性实验计划”项目申请表由申报学生所在学院初审，签署意见后（一式两份），由学院教务办一起报送教务处实践教学管理科。5、如填表有不明事宜，请与教务处实践教学管理科联系和咨询。联系电话：84616053项目名称基于生物工程技术的卷叶贝母有效组分生产关键技术研究申请经费项目负责人姓 名学 号所在学院、专业班级项目中分工签字陈然200710511135生物产业学院生物工程07级1班实验安排、操作、总结项目成员李頔200710511143生物产业学院生物工程07级1班数据整理，实验操作舒平

3、200710511138生物产业学院生物工程07级1班实验准备，操作刘毓均200710511214生物产业学院生物工程07级1班实验准备，操作指导教师情况姓 名王跃华职称教授学历/学位硕士所在学院生物产业学院E-mail地址Wangyaohua888联系电话139800217901.课题来源：科研 教学 设计 工程 自选 其他（ ）2.课题类别：工学 理学 文学 管理 经济 其他（ ）一、 项目简介和前期基础：（包括项目简介300500字；项目前期准备）1、项目简介本项目首次将生物工程的组织培养技术、多倍体诱导技术和细胞悬浮培养技术有机结合，在离体培养条件下，成功地诱导培育出卷叶贝母有效组分含

4、量高、生长速度快的悬浮培养体系；进一步探明卷叶贝母四倍体悬浮培养物中有效成分的积累动态和时空分布规律，并完成对培养物中各化学物质的提取、分离和纯化的工艺研究；最终实现大规模工业化生产卷叶贝母生物碱和甾体皂甙类药物有效组分，极大地缓解卷叶贝母药材市场的紧缺和更有效地保护卷叶贝母野生植物资源。 2、前期基础 在王跃华教授、孙雁霞博士等的大力指导下，我院师生已成功完成了苦荞麦、喜树、川芎、川黄柏、杜仲、板蓝根、红花、青蒿等的多倍体诱导以及含量提取的研究。我们的团队也参加了川黄柏系列现代生物工程技术与示范和名贵中药材川贝母的四倍体悬浮培养体系的建立课题的研究以及进行了对川贝母总生物碱的含量测定、小白鼠

5、药理实验研究，有非常好的动手和动脑能力，为保证课题的顺利完成奠定了基础。实验室充足的实验条件以及相关设备，为保证项目的完成提供了设备支持。川贝母含量测定数据： 不同外植体生物碱含量外植体类型吸光度总生物碱含量（%）50.25040.163740.27250.1972芽0.17580.1644疏松愈伤组织0.22970.1557褐变0.36000.2624小白鼠药理实验数据：二、项目方案和研究内容：（研究意义与目的、现状、工作思路、方法及拟解决主要问题等）1、项目应用前景   目前卷叶贝母野生资源蕴量不足100万公斤，每年可供采挖的卷叶贝母资源不足50万公斤，而市场

6、每年的需求量约400万公斤，这种供需矛盾导致了卷叶贝母市场价格节节攀升。当前除一些知名品牌（如川贝枇杷膏、蛇胆川贝液等）目前仍坚持用正品卷叶贝母外，许多中小企业广泛采用卷叶贝母的替代品，如太白贝母、湖北贝母、东贝母、浙贝母（小个）、平贝母、伊贝母等，市场上甚至出现了大量伪品，如米贝母、一轮贝母、丽江山慈菇、老鸦瓣、唐菖蒲等直接影响了药品制剂的质量和治疗效果，也给临床用药安全造成了极大的影响。   卷叶贝母属于高原濒危药材，目前存在人工栽种难度大、药材生长周期长、有效成分含量低等问题。利用生物技术建立卷叶贝母高产四倍体细胞悬浮培养体系，可大规模、快速生产有效成分含量

7、高、质量可控的优质卷叶贝母药材原料，较好地解决卷叶贝母药用植物栽培周期长，繁殖较困难的难题；并且该技术是在无菌条件下进行的细胞悬浮培养，可排除病菌和虫害的侵扰，严格控制药材质量，完全解决农药残留和重金属含量问题，生产出真正意义上的绿色药物；同时，通过对卷叶贝母离体培养条件的改变，还可进一步筛选出具有明显生理活性的新物质。因此，采用生物技术生产卷叶贝母中药材具有非常广泛的应用前景。       2、立项的必要性及国内外研究现状、发展趋势（1）卷叶贝母资源状况分析      卷叶

8、贝母Fritillaria cirrhosa D. Don是百合科多年生草本植物，以鳞茎入药，为名贵的川产道地药材，堪称药中之宝。卷叶贝母有效成分为贝母生物碱和甾体皂甙类。现代研究表明卷叶贝母为最常用、最有效的止咳化痰药，常用于肺热燥咳,干咳少痰,阴虚劳嗽,咯痰带血。除此之外卷叶贝母在临床上还可以用于治疗肝硬化腹水和小便淋沥。根据曹新伟等人的研究表明卷叶贝母中还可能含有核苷类和酚酸类非生物碱活性物质，在核苷类中腺苷对扩张冠状动脉,松弛平滑肌，镇定中枢神经和血小板的凝集均有一定的疗效，这一研究结果预示着随着对卷叶贝母活性成分的不断深入研究，其用途还将进一步增多。据统计,目前以卷叶贝母为主药或包含

9、卷叶贝母的中成药有130多种，年产值约为50亿元；同时卷叶贝母也是我国重要的出口商品，创汇率高。随着医药卫生事业的发展，人们对卷叶贝母的需求量还将进一步增加，最终导致其价格不断攀升，药材市场的缺口越来越大。       卷叶贝母属于高原濒危药材，长期以来主要靠采挖野生药材为主，由于长期滥采滥挖，再加上生态环境恶化，卷叶贝母野生资源锐减，正面临枯竭的境地。据全国中药资源普查可知，卷叶贝母药物资源被列入我国野生药材资源保护条例的29种国家重点保护植物药材之一，同时也被中国珍稀濒危植物红皮书确定为渐危种，是国家三级濒危保护植物。 （2）卷叶

10、贝母人工栽种现状分析      大量开展人工栽种卷叶贝母药材是解决其供不应求的重要途径。卷叶贝母人工种植方式主要为有性繁殖和营养繁殖2种情况。有性繁殖即种子繁殖，虽然卷叶贝母种子繁殖系数高,但种子地处高原,不易采集, 加之卷叶贝母种子存在形态后熟和生理后熟的特性，因此用种子萌发要经过很长时间的休眠期,并且种子出苗率低,整齐度不理想，生长周期长。究其原因在于卷叶贝母种子休眠机制目前尚未得到系统揭示,而种子层积作用的效果也有待于进一步的研究。当前卷叶贝母在生产中多采用营养繁殖，即用鳞茎进行无性繁殖, 这样方式不仅用种量大, 造成药材的浪费， 而且长

11、久如此栽种, 还易引起品系的退化, 降低对病虫害的抵抗力, 产量也随之大幅度下降。2006年国家科技部确立了“卷叶贝母等濒危药材野生抚育和野生变家种研究”的“十一五”支撑项目（2006BAI06A13），较好地解决了卷叶贝母优质资源的选育及提纯复壮、野生抚育播种方式和野生抚育采挖方式等关键技术，在一定程度上解决了卷叶贝母的人工栽种的问题。但由于卷叶贝母植物具有耐寒、喜湿、怕高温、喜荫蔽的特殊生理特性，只能生长在海拔35004500米的高山灌丛和草甸等地带，这就给卷叶贝母药材野生抚育的人工栽培和生产管理带来了许多困难，同时也在很大程度上限制了卷叶贝母药材的大规模生产。另外，利用野生抚育技术栽培的

12、卷叶贝母药材，生长周期和野生药材一样都需要4-5年较长的时间，并且药材中总生物碱的含量没有明显地增高。当前我国要实现中药现代化与四川省提出的“7+3”优势培育产业发展的重点领域，正好进一步促使了传统中医药与现代生物工程技术相结合。为此，本课题采用生物工程的组织培养技术、多倍体诱导技术和细胞悬浮培养技术相结合，很好地解决卷叶贝母药用植物栽培困难、生长周期长、有效成分含量低的难题，极大地提高有效成分生产率，排除病菌和虫害的侵扰，并从源头上严格控制药材质量，保证卷叶贝母药材的“安全、高效、稳定、可控”问题，大力开发卷叶贝母药材资源。（3）卷叶贝母生物工程繁育的优势分析  

13、0;  由于卷叶贝母药材在生长过程中对环境的温度、土质、气候等条件有特殊的要求，采用生物技术生产卷叶贝母中药材可不受外界环境影响，通过筛选出高产的卷叶贝母细胞株系进行大规模悬浮培养，并对培养基和培养条件进行有效调控，可得到产率高，产量、质量可靠和可控的优质中药原料，最终实现卷叶贝母名贵中药材快速规范化生产的目的。        近年来，为了快速繁殖卷叶贝母以缓解卷叶贝母野生资源面临的危机，国内许多科技工作者进行了组织培养方面的研究工作，并取得一定的成果。例如高燕等人通过研究贝母离体培养,研究了贝母基因型、温光条件、

14、激素配比对贝母愈伤及不定芽的影响，研究出诱导贝母愈伤组织的最佳培养基及诱导不定芽的最佳培养基，建立了完整的不依赖于基因型的贝母植株再生体系。李强、傅华龙等人在研究组培卷叶贝母鳞茎形成和发育过程中，获得愈伤组织、胚性愈伤组织、胚状体、小鳞茎和大鳞茎等，通过对总生物碱含量测定结果显示，组织培养生产的卷叶贝母鳞茎总生物碱含量是野生及市售川贝的24倍；并且还进行了游离全蛋白电泳比较，测得组培鳞茎与野生鳞茎的游离全蛋白图谱完全一致。高山林等人探索出卷叶贝母鳞茎快速增殖的最佳条件，并对组织培养卷叶贝母的化学成分和药理作用进行了研究，检测了通过组织培养获得的鳞茎和商品鳞茎有一致的化学成分，都具有生物碱、有机

15、酸、皂甙氨基酸等13种化学物质；通过药理实验结果显示，组培川贝与野生川贝具有同样镇咳祛痰作用，两药毒性均较低，比较安全。由此可见，通过组织培养生产的鳞茎可以有效地保持原商品药材的有效化学成分，完全可以用组培川贝代替野生川贝供药用，预示用组培技术进行川贝鳞茎的器官培养是扩大川贝药用资源的有效途径。      药用植物是一类具有特殊用途的经济植物，多倍体诱导技术已成为选育优良品种，提高中药材产量和质量的有效途径。这主要是由于药用植物一般以植物的特定器官为收获对象供药用,由于多倍体植株染色体加倍,往往具有器官“巨型性”特征,能较好地满足药材生产的要求

16、。所以多倍体诱导可更大幅度的提高药材的产量；另外，药用植物由于染色体数目加倍，也使得染色体上基因调控有效化学成分含量较正常二倍体也增高，使得次生代谢产物含量也明显的增加，从而进一步提高了药用植物的质量。目前自然环境遭到严重的破坏，野生药用植物资源种类和数量急剧减少，为了更好地解决这一问题，开展药用植物的多倍体诱导是非常重要的。高山林等人最早成功地培育了四倍体丹参优良品系,陈柏君等人采用秋水仙素成功诱导了黄芩同源四倍体，王强、傅华龙等人用秋水仙素诱导出卷叶贝母多倍体愈伤组织，这在卷叶贝母的多倍体研究中是首次报道,对本项目的研究具有一定的指导意义。     

17、 当前，卷叶贝母的生物技术研究主要在试管苗培育、鳞茎再生和多倍体诱导等方面取得了一定的成果。但是，市场上卷叶贝母商品仍然短缺，究其原因主要是因为目前在卷叶贝母中使用的生物技术，都是采用的单一技术，研究的技术成果很难大规模的应用在生产实践中。如采用卷叶贝母组织培育获得的试管苗应用于大田生产时，需要严格的驯化条件和操作管理，且在驯化过程中，试管苗在离体条件下形成的根系往往不能发挥作用而需要重新生根，从而造成移栽成活率低，在实际生产中难以应用。而细胞悬浮培养技术是一种广义组织培养，该技术不需要完成整个试管苗的培养过程，仅通过对愈伤组织和小鳞茎的诱导培养后，将游离的细胞和小鳞茎悬浮在液体培养

18、基中进行的一种培养方法。此种悬浮培养方式使得培养物生长速度明显加快，生长周期大大缩短，操作的技术难度有效降低，并且适合于大规模的工业化生产，是目前生产药用植物有效成分最有希望的途径之一。（4）生物工程技术在中药增产中研究现状分析     悬浮培养技术是当今药用植物实现工业化生产的必经之路，传统中药材对土地、气候、生长年限等环境条件有很大的依赖性。利用生物技术培养高产细胞株系，大规模进行细胞悬浮培养，并不断改善植物细胞体外培养条件，可大大地提高药材细胞中次生代谢的含量，并且还可以通过向培养基中添加药物合成的前体物质，经培养将其转化为目的化合物，以此来增加有

19、效成分的含量，最终实现名贵中药材快速大规模生产药物的目的。     近年来,悬浮培养技术日益完善，国内外学者利用该技术已进行了几十种药材的有效成分生产,其中人参 、红豆杉、毛地黄、紫草、日本黄连等都已实现了工业化生产。如抗癌药物紫杉醇的药用植物红豆杉的细胞悬浮培养物，已可用75 t发酵罐培养生产，实现了大规模商业化生产水平；中国药科大学组培室已进行了人参的大规模生产培养，并对其培养细胞进行化学成分（皂甙、灰分、金属离子、氨基酸）和药理活性（急性毒性、镇静作用、抗疲劳作用、抗高温作用、吞噬机能）比较分析,结果与种植人参无差异；我国工程院院士、上海

20、医科大学的胡之壁教授建立了丹参酮的细胞培养系统，并发现丹参培养物具有丹参酮和隐丹参酮的合成能力，证明了来源于组培根的悬浮培养物中的隐丹参酮的含量为原植物的6.8倍。这充分展示了生物工程技术在生产药物有效组分方面的光辉前景。而目前还未见有关利用生物工程技术大规模地生产卷叶贝母有效成分的研究报道。为此本课题采用多项现代生物工程技术，通过对卷叶贝母离体培养材料的诱导培育，筛选出生长速度快、卷叶贝母有效组分含量高、药理作用优于原药材、无毒副作用和安全可靠的卷叶贝母快速繁殖细胞系，进一步建立生产条件可控并能大规模快速生产卷叶贝母有效组分的培养体系，很好地解决了卷叶贝母药材在传统生产过程中存在的生长条件苛

21、刻、周期长，药材产量和有效成分含量低等问题，最终实现工业化发酵生产卷叶贝母生物碱和甾体皂甙等药物有效组分，以缓解卷叶贝母药材市场的紧缺和更有效地保护卷叶贝母野生植物资源。3、主要目标：采用多项生物工程技术，初步建立卷叶贝母有效组分规模化快速繁殖细胞系，为卷叶贝母有效组分工业化快速生产奠定基础。4、主要内容（1） 建立卷叶贝母快速繁殖体系筛选出有效组分含量高、适宜进行细胞和鳞茎悬浮培养的卷叶贝母外植体和最佳培养基配方及培养条件，建立卷叶贝母愈伤组织和鳞茎快速繁殖培养体系。（2）建立卷叶贝母多倍体诱导技术体系为了明显提高药材中有效组分的含量和增加药材的产量，进行卷叶贝母愈伤组织、鳞茎和种子的多倍体

22、诱导以及对诱导后材料进行染色体核型鉴定试验。将培养的愈伤组织、鳞茎和种子接种到含有特定浓度的秋水仙素培养基上进行多倍体诱导培养；将培养的愈伤组织、鳞茎、种子置于含有特定浓度的秋水仙素溶液中进行一定时间浸泡诱导处理；对所诱导的多倍体材料进行细胞染色体核型鉴定，筛选出诱导成功的卷叶贝母多倍体组织。 （3） 建立快速高产的卷叶贝母多倍体悬浮培养体系卷叶贝母多倍体愈伤组织和鳞茎的悬浮培养基本培养基MS、B5、SH、White等的筛选；培养基中激素配比、接种量、光照条件、碳源、pH值等因素对培养细胞和鳞茎的生长速度和有效组分含量的影响研究；对卷叶贝母多倍体悬浮细胞和鳞茎进行细胞活力的测定，测定培养细胞的

23、生长曲线。（4）多倍体培养产物成份累积及时空分布规律研究采用动态采样检测的方法，应用HPLC等检测技术对卷叶贝母四倍体悬浮培养物中有效组分的动态积累及时空分布规律进行研究。（5）卷叶贝母培养产物分离纯化及药效毒理评价研究采用化学分离等技术对培养产物有效组分进行提取、分离和纯化工艺研究；采用比较药理学和毒理学方法对卷叶贝母多倍体悬浮培养产物进行全面系统的药效学和安全性评价研究。（6）规模化快速繁育技术体系优化初步建立根据上述研究结果，优化培养条件，完善基于生物工程技术的卷叶贝母有效组分的快速繁育关键技术，初步建立大规模工业化生产卷叶贝母药材药用成分的技术体系。5、拟采用的技术路线优良川贝母种质外

24、植体筛选无菌体系建立最佳培养条件的建立建立秋水仙碱诱导川贝母多倍体体系多倍体悬浮培养物成分的测定与含量分析多倍体悬浮培养产物的药理学及安全性评价建立川贝母多倍体悬浮体系初步建立川贝母四倍体悬浮培养工业化生产关键技术多倍体鉴定外植体的选择  卷叶贝母无菌体系的建立  筛选出卷叶贝母鳞茎及愈伤组织诱导、增殖的最佳培养基和培养条件  秋水仙素处理不同浓度、时间以及处理方式的确定  秋水仙素诱导离体培养体系的建立  卷叶贝母四倍体的形态学、细胞学的鉴定  卷叶贝母四倍体细胞的筛选&#

25、160;  卷叶贝母四倍体细胞悬浮体系的建立 卷叶贝母四倍体悬浮培养物成分的提取、纯化、结构分析和含量测定 对卷叶贝母四倍体悬浮培养产物进行全面系统的药理学和毒理学和安全性科学评价 建立在离体培养条件下，大规模工业化生产卷叶贝母有效组分的关键技术。6、研究方案本课题的研究方法是依靠组织培养技术、多倍体诱导技术、细胞悬浮培养技术为支撑点，筛选出卷叶贝母愈伤组织和鳞茎分化增殖的最佳培养基配方和培养条件，研究出种子完成生理、形态后熟的最佳层积条件，采用将秋水仙素加入培养基中和制备成浸泡液两种方式诱导卷叶贝母同源四倍体，并运用细胞悬浮培养的技术建立高产

26、、稳定的卷叶贝母四倍体细胞悬浮体系，最终实现工业化生产卷叶贝母药用成分的目的。（1）建立卷叶贝母快速繁殖体系通过对卷叶贝母各种外植体、激素配比、培养温度、光照强度、培养时间以及接种量等多方面筛选研究，确立卷叶贝母愈伤组织和鳞茎快速增殖的最佳培养基配方及培养条件，建立大规模的卷叶贝母无菌离体培养体系。（2）建立卷叶贝母多倍体诱导技术体系为了提高药材中有效组分的含量和增加药材的产量，选择生长状况良好的卷叶贝母愈伤组织团块和小鳞茎，以及已采用赤霉素并结合低温沙藏层积处理后完成生理和形态后熟的种子，使用将秋水仙素药剂加入培养基中和用秋水仙素溶液浸泡处理两种方法诱导卷叶贝母多倍体；并依据不同的诱导材料，

27、确立出使用秋水仙素溶液的最佳浓度与处理时间。（3）建立快速高产的卷叶贝母多倍体悬浮培养体系和多倍体培养产物成份累积及时空分布规律研究采用植物形态学、组织学和细胞遗传学等技术对诱导后的材料进行多倍体鉴定，选择多倍体诱导率高、生长状况好和有效组分含量高的卷叶贝母材料进行悬浮培养。依据使用卷叶贝母多倍体的材料，从基本培养基的种类、激素配比、接种量、光照条件、碳源、pH值等多方面进行深入研究，确立影响卷叶贝母多倍体细胞悬浮培养生长的因素。测定培养细胞的活力，绘制出悬浮培养细胞的生长曲线，科学的确立多倍体悬浮培养的继代时间和生产周期。定时取样检测悬浮培养细胞中生物碱和甾体皂甙化学物质的变化，弄清卷叶贝母

28、有效组分的积累动态和时空分布规律。开展生物转化研究，将悬浮培养基中的蔗糖浓度提高和适当添加外源前体，进一步提高卷叶贝母各有效组分的含量。（5）卷叶贝母培养产物分离纯化及药效毒理评价研究采用化学分离和制药工程技术完成对悬浮培养物中的有效成份进行提取、分离和纯化工艺研究，并制备卷叶贝母培养有效组分产物的供试品，采用比较药理学和，完成供试品与野生卷叶贝母止咳、化痰、平喘等传统药效学比较研究；采用比较毒理学的方法，完成卷叶贝母培养有效组分安全性评价研究。（6）规模化快速繁育技术体系优化初步建立根据研究结果，调整相关参数，优化培育条件，并放大生产工艺，完善基于生物工程技术的卷叶贝母有效组分的快速繁育关键

29、技术，初步建立大规模工业化生产卷叶贝母药材药用成分的技术体系。7、本项目拟解决以下关键问题 （1）解决了卷叶贝母药用植物在自然界中生长要求条件苛刻，种子繁殖困难，药材生产周期长、产量和有效成分含量低等问题。通过采用生物工程技术进行药材生产，可摆脱自然界的各种影响，极大地提高药材生产率，排除病菌和虫害的侵扰，严格控制药材质量，大规模生产出有效成分含量高、优质可控真正意义上的绿色药物。 （2）研制出快速大规模生产卷叶贝母药材有效组分的关键生产技术，并将古老的中药材生产与现代生物工程技术有机结合，实现了有目的生产我们需要药材有效组分的目的，为中药现代化发展展示了光辉前景。8、关键

30、技术：（1）卷叶贝母高产、稳定离体悬浮培养体系的建立，以及培养基配方和培养条件的筛选。（2）卷叶贝母悬浮培养物中有效成份的提取、纯化和结构鉴定。（3）建立适宜在离体培养条件下，大规模快速生产卷叶贝母有效组分的生产工艺。9、应用方案   该项目由四川省科技厅组织实施，产学研结合。以在蓉的科研院所为主要技术支撑单位，以成都的制药有限公司技术扩散载体并配套投入，国家科技部、四川省科学技术厅、成都市科技局等政府部门给予支持，以科研创新与技术扩散的强势结合为基础，以卷叶贝母四倍体细胞悬浮培养体系的建立研究为突破口，研究与开发相结合，研究与产业相结合，技术平台直接面向成都生物

31、医药科技孵化园，与国内外医药企业建立互惠、互利的紧密型伙伴关系，在新技术的推广或扩散过程中，对外产生辐射和带动。参考文献：1 陈梅花,王慧春,朱艳媚,陈志.贝母的药理研究J 安徽农学通报 2007,13（1）：103-105. 2 谭丰苹,高山林.生长调节物质对组培暗紫贝母小鳞茎生长的影响J. 植物资源与环境,1999,8(1) : 5255. 3高山林,朱丹妮，蔡朝晖，徐德然. 暗紫贝母鳞茎器官培养生长特征和生物碱累积的研究J.中国药科大学学报,1992；23(3)：1 44 147.4唐魏，杨映根，桂耀林，郭仲琛等. 培养条件对平贝母愈伤组织分化的影响.生物技术.1996,6(4):11-

32、14.5王 强,兰利琼,傅华龙.秋水仙素诱导川贝母(Fritillaria cirrhosaD.Don)愈伤组织多倍体的研究J. 武汉植物学研究,2002,20(6):449 452.6张海凤,郑辉,陈新华,郭宝林. 药用植物多倍体研究进展J 河北林果研究，2008.23（2）：169-172. 7刘智慧.美国东部黑核桃种子层积催芽的探讨.山西林业科技.2003.98李志亮,李风.三种贝母种子休眠解除的适温测定.中国医学科学院药用植物资源开发研究所.19959周良骝，谢中稳，张袖丽.安徽贝母种子休眠与萌发的研究.安徽农业大学基础科学部，合肥.1994.910 高文远,李志亮,肖培根.浙贝母种子

33、两种低温解除休眠过程中过氧化物酶同工酶的电泳分析.中国中药杂志.1997 11于婧,魏建和,陈士林,代勇,杨成民.川贝母种子休眠及萌发特性的研究J.中草药.2008,7(39):10811084.12陈瑞阳.植物染色体标本制作的新方法J.植物学报,1979，20（3）：297.13郭启高,宋明,梁国鲁. 植物多倍体诱导育种研究进展J. 生物学通报,2000,35 (2) :812-815.14李萍.刘惠娟.徐国钧.徐路珊.余国奠. 中药贝母类的研究珊湖北产贝母属植物的核型研究J 国药科人学学报. 1991，22（4）：19319615 金兰，罗桂花 低温解除川贝母种子休眠过程中酯酶和过氧化物酶

34、同工酶的变化J. 青海师范大学学报.2007,4.16 宋廷杰，肖杰易，李祥洲.川贝母种子赤霉素处理试验研究.四川省中医药研究院药物种植研究所.17 张寿文,刘贤旺. 贝母属植物的组织培养研究进展J. 江西农业大学学报，2003，25（2）：187 - 19018耿茂林，马琳，常莉，薛建平. 贝母组织培养研究进展J. 淮北煤炭师范学院学报(自然科学版).2007，28(1):38 - 4219陈敏,陈和荣,钟凤林,等.川贝母组织培养的研究J.中国中药杂志,1995,20(8):461 - 462.20蔡朝晖,李萍,高山林.中药贝母的组织培养研究概况J.中草药,1998,29(4):274 -

35、277.6周宝钧.平贝母鳞茎组织培养的研究J.植物生理学通讯.1983，19（1）：30.21 王 强,兰利琼,傅华龙.秋水仙素诱导川贝母(Fritillaria cirrhosaD.Don)愈伤组织多倍体的研究J. 武汉植物学研究,2002,20(6):449 452.22 张海凤,郑辉,陈新华,郭宝林. 药用植物多倍体研究进展J 河北林果研究，2008.23（2）：169-172. 23陈瑞阳.植物染色体标本制作的新方法.植物学报，1979，20(3):297.24 宋福坤,赵勤. 湖北贝母与川贝母总生物碱含量的比较J. 药学进展. 1998,22(1)；495025秦金山,王莉,牛德水.

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37、在药用植物领域应用进展J.中医药导报, 2006, 12 (2) : 83.31王晓杰.用川贝母组方治疗肝硬化腹水J. 中医杂志, 2004,45 (6) : 410.32陈晋宇.川贝母治小便淋沥J. 中医杂志, 2004, 45 (6) : 412.33曹新伟，陈四保，陈士林等.川贝母中非生物碱类成分的研究J.世界科学技术中医药现代化基础研究.2008，10（2）：83-8834 Leifert C, CassellsAC. Microbial hazards in plant tissue and cell cultures. In vitro Cellular&Developme

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39、玲等 银杏致密细胞团颗粒悬浮培养生产银杏内酯研究J.天然产物研究与开发， 2001，13（4）：16-1939宋福坤,赵勤 湖北贝母与川贝母总生物碱含量的比较J. 药学进展.1998年.22(1):49-5041樊君，朱四易，李宝璋 伊贝母细胞悬浮培养的研究J 西北大学学报(自然科学版)，1995年12月，25（6）。42 吕东平,赵德修 ,黄艳，赵乔 前体对水母雪莲悬浮培养细胞黄酮合成的影响J 云南植物研究 43 高山林,朱丹妮,蔡朝辉,徐德然.暗紫贝母鳞茎器官培养生长特征和生物碱累积的研究 J .中国药科大学学报.1992，23(3):14414744 桂镜生, 杨树德. 川贝母与平贝母的资源状况调查及市场供求分析.云南中医学院学报.2008，31（6）45 国务院. 野生药材资源保护管理条例第四条.1987. 10.3046 聂小忠，对历版.中国药典所载川贝品种的探讨 J .中国药房.2008，19（9）：717718 47 耿茂林，马 琳，常 莉，薛建平. 贝母组织培养研究进展 J .淮北煤炭师范学院学报 .2007，28(1)48 川贝母栽培技术.华夏星火增刊.（农村实用技术专辑 种植篇）2007，8 S567.249 李玉美.