下游技术概论1

1、下游技术概论下游技术概论下游技术概论下游技术概论第一节 酶的提取与分离纯化概述第二节 蛋白酶的初步回收第三节 酶的浓缩和初步纯化第四节 酶的层析纯化 下游技术概论下游技术概论第三节 酶的浓缩和初步纯化 对目标蛋白浓度很低的溶液进行浓缩，可以使抽提的体积对后面的纯化步骤更易操作。 实验室用于浓缩的方法主要有沉淀分离、超滤、离子交换层析、真空透析、冷冻干燥、加入干燥的Sephadex G-25等；对于大规模应用，一般使用沉淀、离子交换层析或超滤 下游技术概论下游技术概论第三节 酶的浓缩和初步纯化（一）沉淀分离 是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶在溶液中的溶解度降低，从溶液中析出沉淀而与其它溶质

2、分离的技术过程下游技术概论下游技术概论第三节 酶的浓缩和初步纯化（一）沉淀分离(1) 操作简便、经济、浓缩倍数高(2) 用于纯化前处理或最后产物收集(3) 针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 下游技术概论下游技术概论第三节 酶的浓缩和初步纯化（一）沉淀分离 沉淀分离的方法主要有： 1 盐析沉淀法 2 等电点沉淀法 3 有机溶剂沉淀法 4 复合沉淀法 5 选择性变性沉淀法 下游技术概论下游技术概论（一）沉淀分离 1 盐析沉淀法 利用不同蛋白质在不同盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。 盐析法在酶的分离纯化中被

3、广泛使用，主要用于蛋白类酶的分离纯化。 盐析原理盐析原理生物大分子在水溶液中的存在状态：（1）两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系（2）蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞盐析原理盐析原理 当中性盐加入蛋白质分散体系时：（1）“盐溶”现象 低盐浓度下，蛋白质溶解度随之增大（2）“盐析”现象 高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降 盐析原理盐析原理 盐析原因：（a）无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；（b）中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉

4、淀； 盐析用盐的选择盐析用盐的选择 选用盐析用盐的几点考虑：（1）盐析作用要强（2）盐析用盐需有较大的溶解度（3）盐析用盐必须是惰性的（4）来源丰富、经济 在蛋白质盐析中，以硫酸铵最为常用。 在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示：饱和度指溶液中饱和硫酸铵的体积与溶液总体积之比。 例：80ml酶液加入20ml饱和硫酸铵溶液，则混合液中的硫酸铵饱和度为20（80+20）= 0.2第三节第三节 酶的浓缩和初步纯化酶的浓缩和初步纯化1 盐析沉淀法 饱和硫酸铵溶液的配制：水中加入过量固体硫酸铵加热50-60，保温数分钟趁热滤去未溶硫酸铵滤液在0或25平衡1-2天，有固体析出时，即达100%饱和度

5、。 25时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度第三节第三节 酶的浓缩和初步纯化酶的浓缩和初步纯化1 盐析沉淀法盐析注意事项盐析注意事项 1 1、确定沉淀蛋白质所需硫酸铵浓度的方法、确定沉淀蛋白质所需硫酸铵浓度的方法 将少量样品冷却到05，然后搅拌加入固体硫酸铵粉末，蛋白质沉淀时，分析上清液确定目的蛋白质浓度；如它仍在溶液中则弃去沉淀，再加更多的硫酸铵于上清液中，直到目的蛋白质沉淀为止。 以目的蛋白在溶液中的浓度对硫酸铵浓度作图，得沉淀曲线，找出蛋白质开始沉淀的浓度。如不考虑收率，饱和度区间可取得窄一些，使纯度高一些。 盐析注意事项盐析注意事项 2、盐的饱和度盐的饱和度 不同

6、蛋白盐析时要求盐的饱和度不同。分离蛋白质混合物时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加，对出现的每一种蛋白质沉淀依次进行离心或过滤，便可得到不同的蛋白质成分。 例如： 血浆蛋白质的盐析分离 硫酸铵饱和度达20%时，纤维蛋白原 2833%时，优球蛋白 3350%时，拟球蛋白析出 大于50%时，清蛋白析出盐析注意事项盐析注意事项 3 3、pH pH 值值 pH值在等电点时蛋白质溶解度最小易沉淀析出。因此盐析时除个别特殊情况外，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。由于硫酸铵有弱酸性，它的饱和溶液的pH值低于7，如所要蛋白质遇酸易变性则应在适当缓冲液中进行。盐析注意事项盐析注意事项 4 4、蛋白质浓度、蛋

7、白质浓度 在相同盐析条件下蛋白质浓度愈高愈易沉淀。使用盐的饱和度的极限也愈低。 如血清球蛋白浓度从0.5%增至3.0%时,需用中性盐饱和度的最低极限从29%递减至24%。 蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利,但浓度过高也易引起杂蛋白的共沉淀作用。因此,必须选择适当浓度尽可能避免共沉淀作用的干扰。盐析注意事项盐析注意事项 5 5、温度、温度 通常蛋白质盐析时对温度要求不太严格，盐析操作一般可在室温下进行。至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件。但在中性盐中结晶纯化时，温度影响则比较明显。盐析注意事项盐析注意事项 6 6、脱盐、脱盐 蛋白质用盐析法分离沉淀后，常需脱盐才能获得纯品。 脱盐方法最常用的

8、是透析法，透析法所需时间较长，常在低温下进行并加入防腐剂避免微生物污染。 下游技术概论下游技术概论第三节 酶的浓缩和初步纯化（一）沉淀分离（一）沉淀分离 2 2 等电点沉淀等电点沉淀 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法等电点沉淀法等电点沉淀法 原理：蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。 特点：由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀

9、法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用 下游技术概论下游技术概论第三节 酶的浓缩和初步纯化（一）沉淀分离 3 有机溶剂沉淀 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法 3 有机溶剂沉淀 原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，破坏水膜，使蛋白质溶解度降低，导致脱水凝聚。第三节 酶的浓缩和初步纯化 3 有机溶剂沉淀 特点：（1）分辨率高（2）溶剂容易分离，并可回收使用（3）产品洁净（4）容易使蛋白质等生物大分子失活，

10、应注 意在低温下操作第三节 酶的浓缩和初步纯化 3 有机溶剂沉淀 溶剂选择： （1）介电常数要小 （2）致变性作用要小（甲醇） （3）毒性要小、挥发性适中 （4）水溶性要好第三节 酶的浓缩和初步纯化 3 有机溶剂沉淀 影响有机溶剂沉析的主要因素：（1）温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）（2）搅拌速度（3）溶液 pH 值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象第三节 酶的浓缩和初步纯化 3 有机溶剂沉淀 影响有机溶剂沉析的主要因素（4）离子强度：离子强度低有利于沉析，（5）样品浓度：稀溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小；浓节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低

11、（6）金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+第三节 酶的浓缩和初步纯化 第三章第三章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化第三节 酶的浓缩和初步纯化（一）沉淀分离 4 复合沉淀法 指在酶液中加入某些物质，与酶形成复合物而沉淀下来，再用适当方法将酶从复合物中重新析出的方法. 第三章第三章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化第三节 酶的浓缩和初步纯化（一）沉淀分离 5 选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶。第三节 酶的浓缩和初步纯化（一）沉淀分离 缺点：1 许多沉淀剂都是高腐蚀性；2 如果起始蛋白质浓度很低，使用沉淀方法一般是无效的；3 有些

12、沉淀剂是高度易燃的；4 许多沉淀剂使用后必须适当处理；5 许多情况下在进一步操作前必须去除残留的沉淀剂 第三章第三章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化第三节 酶的浓缩和初步纯化（二）结晶 是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。沉淀是形成无定型物质的过程，而结晶是得到晶形物质的过程。晶体内部有规律的结构，晶体的形成必须是相同的离子或分子按一定距离周期性地定向排列而成，所以能形成晶体的物质是比较纯的。 第三章第三章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化第三节 酶的浓缩和初步纯化（二）结晶 重结晶：从比较不纯的结晶再通过结晶作用精制得到较纯的结晶这一过程叫做重结晶(或称再结晶、复结晶) 。 结晶是

13、分离纯化蛋白质、酶等生化产品的一种有效手段 第三章第三章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化第三节 酶的浓缩和初步纯化（二）结晶 结晶过程：当溶液浓度等于溶质溶解度时，该溶液称为饱和溶液。溶质在饱和溶液中不能析出。溶质浓度超过溶解度时，该溶液称为过饱和溶液。溶质只有在过饱和溶液中才有可能析出。 第三章第三章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化第三节 酶的浓缩和初步纯化（二）结晶 结晶过程：结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。这一过程不仅包括溶质分子凝聚成固体，还包括这些分子有规律地排列在一定晶格中。 第三章第三章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化第三节 酶的浓缩和初步纯

14、化（二）结晶 结晶过程：在一定的过饱和浓度条件下，最先析出的微小颗粒是以后结晶的中心，称为晶核。晶核形成后，靠扩散而继续成长为晶体。因此，结晶包括三个过程即：过饱和溶液的形成；晶核的形成及晶体的生长结晶过程考虑因素结晶过程考虑因素 (1) 纯度 一般说来纯度愈高愈易结晶。就蛋白质和酶而言，结晶所需纯度不低于50，总的趋势是越纯越易结晶。结晶的制品并不表示达到了绝对的纯化，只能说达到了相当纯的程度。但有时纯度虽不高，若加入有机溶剂和制成盐时，也能得到结晶。结晶过程考虑因素结晶过程考虑因素 (2) 浓度 在合适的浓度条件下，溶液中溶质分子或离子间有足够的相碰机会，并按一定速率作定向排列聚合形成晶体

15、。 结晶过程考虑因素结晶过程考虑因素 (2) 浓度 浓度太高达到饱和状态时，溶质分子在溶液中聚集析出的速度太快，超过这些分子形成晶体的速率，相应溶液粘度增大，共沉物增加，反而不利于结晶析出，只获得一些无定形固体微粒，或生成纯度较差的粉末状结晶。 结晶液浓度太低，样品溶液处于不饱和状态，结晶形成的速率远低于晶体溶解的速率，也得不到结晶。结晶过程考虑因素结晶过程考虑因素 (3) pH 值 pH 值的变化可以改变溶质分子的带电性质，是影响溶质分子溶解度的一个重要因素。在一般情况下，结晶液所选用的 pH 值与沉淀大致相同。 结晶过程考虑因素结晶过程考虑因素 (3) pH 值 蛋白质、酶等生物大分子结晶

16、的pH 值多选在该分子的等电点附近。如果结晶时间较长并希望得到较大的结晶时，pH 值可选择离等电点远一些，但必须保证这些分子的生物活性不受损害。当然对不同蛋白质及生化产品所要求的pH值范围宽窄不一，要视具体情况来定。如细胞色素c 的等电点为9.810.1，pH 6.0左右生成的结晶最佳。 结晶过程考虑因素结晶过程考虑因素 (4) 温度 冷却速度及冷却温度直接影响结晶效果。冷却太快引起溶液突然过饱和，易形成大量结晶微粒，甚至形成无定形沉淀。冷却的温度太低，溶液浓度增加，也会干扰分子定向排列，不利于结晶的形成。结晶过程考虑因素结晶过程考虑因素 (4) 温度 低温不仅溶解度低，而且不易变性，并可避免

17、细菌繁殖。在中性盐溶液中结晶时，温度可在0至室温的范围内选择。 结晶过程考虑因素结晶过程考虑因素 (5)时间 不同化合物结晶形成和生长所需时间不同。蛋白质、酶等生物大分子结晶时，由于分子内有许多功能基团和活性部位，其结晶形成过程也复杂得多。结晶过程考虑因素结晶过程考虑因素 (5)时间 与简单无机或有机分子相比，尽管蛋白质分子形成晶核时，只需很少个分子即可，但这几个分子整齐排列成晶核时比几十个、几百个分子、离子所费时间多得多，所以蛋白质、核酸等生物大分子形成结晶常需要较长时间。 下游技术概论下游技术概论第三节 酶的浓缩和初步纯化（二）结晶 酶结晶方法： 1 盐析结晶法； 2 有机溶剂结晶法； 3

18、 透析平衡结晶法； 4 等电点结晶法 下游技术概论下游技术概论（二）结晶 1 盐析结晶法：在适当温度和pH等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度慢慢降低，达到稍微过饱和状态而析出酶晶体的过程 下游技术概论下游技术概论（二）结晶 2 有机溶剂结晶法：在接近饱和的酶液中缓慢加入某种有机溶剂，使酶的溶解度降低，而析出酶晶体的过程 下游技术概论下游技术概论（二）结晶 3 透析平衡结晶法：将酶液装入透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程 下游技术概论下游技术概论（二）结晶 4 等电点结晶法：通过缓慢改变浓酶液的pH，使之逐渐达到酶的等电点，而使酶析出结晶的过程 下游技术概论下游技术概论第三节 酶的浓缩和初步纯化（二）浓缩与干燥 一、浓缩 是从低浓度溶液中除去部分水或其它溶剂而成为高浓度溶液的过程。 生化产品制备工艺中