实验2微生物培养基的配制和灭菌

1、实验二实验二 培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌目目 的的 要要 求求了解培养基的配制原理和方法，掌握其了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。配制过程。学习并掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作学习并掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作技术技术 实实 验验 原原 理理由人工方法配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的由人工方法配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质称为营养基质称为培养基培养基。主要用于微生物的分离、培养、鉴。主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏或积累代谢产物等方面。定、菌种保藏或积累代谢产物等方面。可按可按组成成分组成成分和和物理状态物理状态进行分类。进行分类。高压蒸汽

2、灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的高压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的高压蒸汽灭菌锅中进行的，通过加热，产生大量蒸汽使其中压力升高，从而得锅中进行的，通过加热，产生大量蒸汽使其中压力升高，从而得到高于到高于100100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。实实 验验 材材 料料各种药品：各种药品：牛肉膏、蛋白胨、琼脂等；牛肉膏、蛋白胨、琼脂等；称量工具：称量工具：托盘天平、量筒、称量纸、角匙；托盘天平、量筒、称量纸、角匙；分装工具：分装工具：铁架台、漏斗、铁架台、漏斗、pH试纸；试纸；包扎工

3、具：包扎工具：牛皮纸、扎绳、棉花。牛皮纸、扎绳、棉花。实实 验验 程程 序序（培养基的配制与分装培养基的配制与分装 ）1配方：配方： NaCL 0.5、蛋白胨、蛋白胨 1、牛肉膏、牛肉膏 0.3，琼脂琼脂1.5-2.0， pH7.2-7.4 (使用使用10 NaOH和和 5 HCL调节调节)。2配制：配制： 称量及加热溶化称量及加热溶化-加琼脂加琼脂-定容定容-调调pH-分装、加塞、包扎。分装、加塞、包扎。3分装：分装： 每组装每组装3个三角瓶，个三角瓶，150ml/瓶，包扎、灭菌。瓶，包扎、灭菌。将剩余的将剩余的250ml分装大试管（装量为试管长度分装大试管（装量为试管长度的的1/5），加棉

4、球，包扎、灭菌。），加棉球，包扎、灭菌。细菌培养基细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基）平板计数琼脂（平板计数琼脂（PCA）Plate Count Agar10 000mlml配方：配方： 胰蛋白胨胰蛋白胨 5.0g ；酵母浸粉；酵母浸粉 2.5g；葡萄糖葡萄糖 1.0g 琼脂琼脂 15.0g；蒸馏水；蒸馏水 1000ml；pH 7.0士士0.2制法：制法： 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管。分装试管或锥形瓶，或锥形瓶，121高压灭菌高压灭菌15min。 成品用法：成品用法：称取本品称取本品 23.5g,加热搅拌溶解于加热搅

5、拌溶解于 1000ml 蒸馏蒸馏水中水中,分装三角瓶分装三角瓶,121高压灭菌高压灭菌 15 分钟分钟,备用。备用。 1配方：配方： K2HPO4 0.1% MgSO4.7H2O 0.05% FeSO4 0.001% （加（加3滴即可）滴即可） KCL 0.05% NaNO3 0.2% 葡萄糖葡萄糖 3% 琼脂琼脂2% 。2配制：配制： 称量及溶化称量及溶化-加琼脂加琼脂-定容定容-分装、加塞、包扎分装、加塞、包扎3分装：分装： 平均分装在两个三角瓶中，包扎、灭菌。平均分装在两个三角瓶中，包扎、灭菌。霉菌培养基霉菌培养基（察氏一号培养基）（察氏一号培养基）（一）配方（一）配方（PDA） 马铃薯

6、马铃薯200g，葡萄糖，葡萄糖20g，琼，琼脂脂1520g，自来水，自来水1000ml，pH自然。自然。（二）制作方法（二）制作方法1、制滤液、制滤液 ： 马铃薯刮去粗皮，去马铃薯刮去粗皮，去芽眼，切成碎块，称量后放锅中，芽眼，切成碎块，称量后放锅中，加水加水12001300ml，将其煮沸，将其煮沸20min。用双层纱布过滤，取。用双层纱布过滤，取1000ml滤液。滤液。PDA培养基的配制培养基的配制2、化琼脂、化琼脂 将滤液加热至即将沸腾时加入琼脂，将滤液加热至即将沸腾时加入琼脂，不断搅拌（控制火力不要使培养基溢出不断搅拌（控制火力不要使培养基溢出或烧焦）。琼脂完全融化后加入剩余原或烧焦）。

7、琼脂完全融化后加入剩余原料，并使其溶解（用热水不足水量）。料，并使其溶解（用热水不足水量）。3、分装、分装 通过漏斗装置，趁热将培养基分装于通过漏斗装置，趁热将培养基分装于试管中，装量约占试管高度的试管中，装量约占试管高度的1/4（分（分装三角瓶，其装量以不超过其容积的一装三角瓶，其装量以不超过其容积的一半为宜）。管口或瓶口不要沾染培养基。半为宜）。管口或瓶口不要沾染培养基。（如图）（如图）4、包扎、包扎 管口堵入棉塞后管口堵入棉塞后7或或9支试管扎一捆，棉塞部分用牛皮支试管扎一捆，棉塞部分用牛皮纸包扎。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓纸包扎。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日

8、期等，操作过程参见图。名、日期等，操作过程参见图。马铃薯马铃薯葡萄糖葡萄糖琼脂琼脂（PDA)成品成品配方：配方： 马铃薯浸粉马铃薯浸粉 5.0g /L；葡萄糖葡萄糖 20.0g /L 琼脂琼脂 20.0g /L ；氯霉素；氯霉素0.1g /L。制法：制法： 称取称取40g溶于溶于1L蒸馏水中，煮沸溶解。分装试管或锥蒸馏水中，煮沸溶解。分装试管或锥形瓶，形瓶，121高压灭菌高压灭菌15min。 放线菌培养基（改良高氏放线菌培养基（改良高氏1号）号）配方：配方： 硝酸钾硝酸钾1.0g/L，磷酸二氢钾，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁，硫酸镁0.5g/L，硫酸，硫酸亚铁亚铁0.01g/L，氯化钠，氯化

9、钠0.5g/L，可溶性淀粉，可溶性淀粉20.0g/L，琼脂，琼脂15.0g/L.制法：制法： 称取称取37.5g加热溶于加热溶于1L蒸馏水中，蒸馏水中，121高压灭菌高压灭菌15min，冷却至冷却至50-55 时，每时，每300ml培养液中加入培养液中加入3%重铬酸钾重铬酸钾1ml，混匀，倒入无菌平皿。，混匀，倒入无菌平皿。 实实 验验 程程 序序（准备工作（准备工作 ） 取取6支小试管各加支小试管各加生理盐水生理盐水9ml,包扎灭菌。包扎灭菌。 取取1只三角瓶加只三角瓶加99ml水及水及1015粒玻粒玻 璃球，包扎灭菌。璃球，包扎灭菌。 1.灭菌器内加入一定量水，将包扎好的物品放入其中。灭菌

10、器内加入一定量水，将包扎好的物品放入其中。 2.接通电源，进行加热。接通电源，进行加热。 3.排除高压锅内的冷空气排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；（排气阀；（或关闭排气阀，待压力上升到或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待时再打开排气阀，待压力回复到压力回复到0时再关闭排气阀。）时再关闭排气阀。） 4.当压力达当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为时，此时灭菌器内的温度为1210C，维，维持持30min。（。（对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。）降低压力，延长时间。） 5.灭菌时间一到，切断电源，待灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时压力降至零时，才能打开排气阀，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。然后打开灭菌器盖，取出物品。高高 压压 蒸蒸 汽汽 灭灭 菌菌 法法 （手提式高压蒸汽灭菌锅）（手提式高压蒸汽灭菌锅）实实 验验 程程 序序 （善后工作（善后工作 ） 将将6支三角瓶放回支三角瓶放回仪器橱中，小试管放仪器橱中，小试管放到小烧杯中，到小烧杯中，不能放倒。不能放倒。 将灭好菌的试管，摆成斜面，备用。将灭好菌的试管，摆成斜面，备用。1、你所作的培养基是否有异常现象