转基因大豆检测试验设计

1、实用文档转基因大豆的检测实验设计生物技术安全评估092012年5月目录前言 3.实验一大豆样品的准备 4实验二大豆DNA的提取和纯化 4实验三靶标基因的扩增 6实验四反应产品检测 10实验五结果分析 12参考文献 12、八 、，刖言随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物(Gen etically Modified Orga nism)及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。抗草甘膦(glyphosate ) 大豆(商品名，roundup ready soybean )是在传统 大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35启动子

2、、抗草甘膦基 因CP4-EPSP和NO终止子而得到。它是目前使用最广的转基因作物之 一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。因此，研究抗草 甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。基于核酸的检测技术主要有 PCR方法和基于PCR原理的其他检测方法如多重PCR巢式PCR等 等。普通PCR方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。 这些标准涉及的转基因作物有大豆(SN/T 1195-2003)、玉米(SN/T 1196-2003)、棉花(SN/T 1199-2003)、油菜籽(SN/T 1197-2003)、烟 草(SN/T

3、1200 -2003) 和马铃薯(SN/T 1198 -2003)。目前广泛应用 于进出口商品的转基因成分检测。随后在 2004年又制定了转基因定 性检测的国标(GB/T 19495.4-2004)，该国标中用的方法还是普通 PCR因此，普通PCR方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研 究。本实验以三种大豆为材料进行比较，通过对其DNA勺提取和纯化， 靶标基因的获取及琼脂糖电泳分析，从而鉴定所检测大豆样品。采用PC脸测转基因大豆的方法，主要是采用琼脂糖凝胶电泳法，首先检测CAMV-35启动子进行筛选，然后检测EPSP抗草甘膦基因实验一大豆样品的准备样品来源：(原始样品最小质量为：11200克

4、)1、阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质(IRMM-410R Fluka公司)2、进口转基因大豆样品3、非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。样品加工过程：1、构成原始样品(原始样品不得低于试验样品的 4倍)2、样品的初步处理(去皮、去壳、除水、除油等应记录初步处理前后样品 的质量变化)3、破碎和研磨4、缩分5、实验室样品的制备(实验室样品的最小质量不能小于原始样品最小质量 的 1/16)6、存查样品和式样的制备实验二大豆DNA的提取和纯化（CTAB法）一实验目的掌握用CTAB法提取真核细胞总 DNA的原理、步骤和注意事项。二实验原理1、 CTAB(hexadecyltrimethylamm

5、onium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子 去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15C时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须 预热，且离心时温度不要低于15C。2、CTAB提取缓冲液各成分的作用：(1) Tris-HCI (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏(2) EDTA螯合 Mg2+或 Mn2+离子，抑制 DN

6、ase活性(3) NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中(4) C3 -巯基乙醇是抗氧化剂 ，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA(5 )主要作用物质就是氯仿，所以它占有的比例较大，而异戊醇的主要就是防止起泡 泡。三实验仪器和实验试剂1. 仪器：水浴锅 离心机EP管电泳仪研钵2. 试剂：去离子水 乙醇 氯仿-异戊醇 液氮CTAB缓冲液：CTAB 20g/L , Tris-HCI 0.1 mol/L（pH8. 0）， EDTA 0.02 mol/L.TE 缓冲液：lo mmol/L Tris. ，1 mmol/I, EDTA ， pH8.0）.酶溶液：5卩g

7、/卩l.材料：阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质（ IRMM-410R Fluka公司）、进口转基因大豆样 品和非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。四实验步骤（三种材料分别进行）1. 洗干净大豆叶片，用 75%勺酒精表面消毒 3min,用去离子水冲洗 34次2. 称取1g叶片放入灭过菌的研体中，加入液氮捣碎，迅速转入2ml离心管中。3. 加入600卩l CTAB缓冲液，震荡均匀，65C温育30min.4. 加入500ul酚：三氯甲烷：异戊醇（25:24:1 ），振荡均匀，12000r/min , 离心15min。5. 吸取上清液，放入另一新管中，加入等体积的异丙醇，12000r/min，离

8、心10min。6. 弃去上清液，加入 70%乙醇溶液洗涤，12000r/min，离心1min。7. 弃去上清液，干燥，用50卩l TE溶液溶解沉淀。8. 加入5卩l RNA酶溶液，37C温育30min。9. 加入400卩l的CTAB溶液，振荡均匀。10. 加入250卩l的三氯甲烷：异戊醇，振荡均匀， 12000r/min，离心15min。11. 吸取上清液，放入另一个新管中，加入200卩l的异丙醇，12000r/min ,离心10min。12. 弃去上清液，干燥，用50卩l TE缓冲液溶解沉淀。五实验结果获取大豆的DNA六注意事项1. 研磨组织块用于 DNA提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，

9、如采样后，不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70 C的冰箱中保存。2. 整个抽提过程，要尽量避免DNA酶的污染，全程配戴一次性手套，皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染DNA的抽提并成为DNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯，预防微生物污染。本实验亦可用试剂法。（takara 公司：首页-产品分类目录 -DNA Extraction Kit for GMODetection ）实验三靶标基因的扩增一 大豆内源基因lectin 的检测1、范围本方法规定了大豆物种特异性单拷贝基因序列的常规检测程序。本方法适用于评价从大豆加工产品中提取的DNA质量，并可判断是否有足量的DNA用于基因成分检

10、测。2、原理通过PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大小为118bp的大豆Lectin基因片段。3、检测下限本方法能检测0.1 ng的大豆DNA4、试剂一般要求按照GB/T 19495.1 2004的要求执行。水10 X PCR缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mmol/L.dNTP溶液：各 2.5 mmol/L.引物：A、正向引物大豆 Lect in 基因（Gen eBa n?编号：K00821）5' -GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3B、反向引物大豆 Lect in 基因（Gen eBa n?编号：K00821）5' -GCC CAT CTG C

11、AA GCC TTT TTG TG-3Taq 酶：5 IU/ 卩 L5、仪器：PCF仪、电泳仪6、PCF扩增PCF反应体系本方法中中，PCR反应的总体积为25卩L,反应体系见表A.1。可以在不改变试 剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。表（A?） B.1 PCR 反应体系试剂终浓度加样体积/卩L样品DNA10 ng50 ng1水M5.910xPCF缓冲液（不含氯化镁）1x2.5氯化镁溶液（25 mmol/L）1.5 mmol/L*1.5dNTF溶液(10 mmol/L)0.8 mmol/L2正向引物（5卩mol/L ）0.2 卩 mol/L1反向引物（5卩mol/L ）0.2 卩 mol/LP1

12、Taq 酶（5 IU/ 卩 L）0.5 IU0.1注：如PCR缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为1.5 mmol/L.PCF反应参数PCF反应参数见表A.2。使用不同的PCF仪，可对参数作适当地调整表B（A?） .2 PCR反应参数预变性10min, 95° C扩增20s, 95° C40s, 60° C40s, 72° C循环数40最终延伸3min, 72° C7、结果判断如果PCR产物通过电泳确证，可表述样品 DNA溶液中含有来源于大豆的可扩 增的DNA二 转基因大豆DNA（CaMV 35启动子）筛选检测方法1、范

13、围本方法规定了 CaMV 35S启动子不同拷贝数的定性 PCF检测方法。本方法适用于转基因大豆CaMV 35S启动子的筛选检测。2、原理通过PCF扩增的凝胶电泳分离可得到大小为 195bp的CaM35S启动子基因片 段。3、检测下限本方法未确定绝对检测下限。相对检测下限可以检测含有0.1% （质量分数）转基因抗草甘磷大豆粉（IRMM-410）。4、试剂一般要求按照GB/T 19495.1 2004的要求执行。水10 X PCR缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mmol/L.dNTP溶液：各 2.5 mmol/L.引物：A、正向引物CaMV 35Sn动子（GeneBan?编号：V00141）

14、5' -GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3B、反向引物CaMV 35Sn动子（GeneBan?编号：V00141）5' -GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3Taq 酶：5 IU/ 卩 L限制性内切酶 Xmn I (=Asp 700)5、仪器：PCF仪、电泳仪6、PCF扩增PCF反应体系本方法中中，PCR反应的总体积为25卩L,反应体系见表B.1。可以在不改变试 剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。表B.1 PCR反应体系试剂终浓度加样体积/卩L样品DNA10 ng50 ng1水15.910xPCR缓冲液(不含氯化镁)1x2.5氯化镁溶液(

15、25 mmol/L)1.5 mmol/L1.5dNTF溶液(10 mmol/L)0.8 mmol/L2正向引物(5卩mol/L )0.2 卩 mol/Lr 1反向引物(5卩mol/L )0.2 卩 mol/L1Taq 酶(5 IU/ 卩 L)0.5 IU0.1注：如PCR缓冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为1.5 mmol/L.PCF反应参数PCF反应参数见表B.2。使用不同的PCF仪，可对参数作适当地调整表B.2 PCR反应参数预变性10min, 95° C扩增20s， 95° C40s， 54° C40s， 72° C循环数4

16、0最终延伸3min, 72° C7、结果判断如果具备下列条件，就能确定检测到目标序列：PCF扩增产生195 bp的DNA片段；经过序列分析，未知样品PCF扩增条带的DNA序列与阳性对照DNA序列一致；用限制性内切酶 Xmn I酶切PCR产物产生115 bp和80 bp两个片段；三抗草甘膦除草剂基因的检测1、范围本方法规定了在原料中加工产品中检测转基因抗草甘膦除草剂(Roun dupReady/")大豆的定性PCR方法。本方法适用于对原料和加工产品中转基因成分检测，不适用与对基因堆积品种的转基因成分检测。2、原理通过PCF扩增的凝胶电泳分离可得到大小为 172bp的DNA片段

17、，包括CaM35S 启动子和矮牵牛叶体运输肽部分序列。3、检测下限根据每个基因组中的结构基因是 1个拷贝和每个基因组的大小为1.13X109bp 的假设，PCR佥测绝对下限为50ngDNA相当于40个基因组。4、试剂一般要求按照GB/T 19495.1 2004的要求执行。水10 X PCR缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mmol/L.dNTP溶液：各 2.5 mmol/L.引物：A、正向引物CaMV 35SS 动子（Gen eBa n? 编号：V00141J02048）5' -TGA TGT GAT ATC TCC ACT GAC G-3B、反向引物矮牵牛叶绿体运输肽基因（Ge

18、n eBa n? 编号：M21084 J03227）5' -TGT ATC CCT TGA GCC ATG TTG T -3Taq 酶：5 IU/ 卩 L杂交探针5' -GGG TCT TGC GAA GGA TAG TG'-3预杂交溶液5xSSC , 0.1%N-月桂酰肌氨酸（质量浓度），0.2%SDS（质量浓度），19終止液。 杂交溶液在2.5mL预杂交溶液中加入10pmol杂交探针。杂交反应的温度为 50 摄氏度。5、仪器：PCF仪、电泳仪6、PCF扩增PCR反应体系本方法中中，PCR反应的总体积为25卩L,反应体系见表C.1。可以在不改变 试剂浓度的情况下，适当

19、扩大反应体系。表C.1 PCR反应体系试剂终浓度加样体积/卩L样品DNA10 ng50 ng1水r 15.910xPCR8冲液（不含氯化镁）1x2.5氯化镁溶液（25 mmol/L）1.5 mmol/LM.5dNTF溶液(10 mmol/L)0.8 mmol/L2正向引物（5卩mol/L ）0.2 口 mol/L1反向引物（5卩mol/L ）0.2 卩 mol/Lr 1Taq 酶(5 IU/ 卩 L)0.5 IU0.1注：如PCR冲液中已经含有氯化镁，则氯化镁在反应混合液的终浓度应调整为1.5 mmol/L.PCF反应参数PCF反应参数见表A.2。使用不同的PCF仪，可对参数作适当地调整表C.

20、2 PCR反应参数预变性10min, 95° C扩增20s， 95° C40s, 60° C40s, 72° C循环数40最终延伸3min, 72° C7、结果判断如果具备下列条件，就能确定检测到目标序列： PCF扩增产生172bp的DNA片段；杂交实验确证，DNA探针能够特异性杂交PCF产物；经过序列分析确证，未知样品 PCRT增条带的DNA序列与阳性序列一致；根据以上反应条件分别进行以下操作：1、对三种来源的大豆 DNA顺序为：阳性转基因大豆产品、进口转基因大豆、普通大豆样品，分别标记为：1、2、3号和不加样品DNA的空白对照组标记为 11

21、号，进行CaMV 35S启动子的PCRT增；2、 对三种来源的大豆 DNA顺序为：阳性转基因大豆产品、进口转基因大豆、普通大豆样品，分别标记为：4、5、6号和不加样品DNA的空白对照组标记为 12号，进行抗草甘膦基因 PCRT增；3、 对三种来源的大豆 DNA顺序为：阳性转基因大豆产品、进口转基因大豆、普通大豆样品，分别标记 为：7、8 9号和不加样品DNA的空白对照组标记为 13号，进行lectin 基因PCR扩增。准备好 TaKaRa DNA Marker:DL500.本实验亦可用试剂法。（Takara公司： 首页-产品分类目录 -PCR Screening Kit for GMSoybe

22、an Ver.2.0）实验四反应产品检测一实验目的1、掌握琼脂糖电泳的基本技术。2、了解琼脂糖凝胶电泳的原理。二实验原理琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）或EB替代物可与 DNA分子形成EB-DNA复合物在紫外光照射下发射荧光，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。三、仪器与试剂1、仪器：电泳仪、微波炉

23、2、 试剂：凝胶回收试剂盒、TAE Buffer、电泳上样缓冲液、 EB替代品四实验步骤1、 取30 mL TAE缓冲液加入三角瓶后，加0.3 g琼脂糖，使琼脂糖含量为 1%质量体积比）2、胶液的制备：将上述混合物放入或电炉上加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。待混合物冷却至50-60 C时，加入一定量的 EB替代物3、胶板的制备：将胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子。然后将2中的混合物趁热倒入胶槽中，倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子（一般20min左右即可）。然后将胶块轻轻取出， 放到电泳槽中（注意

24、摆放的方向，上样孔在负极端，因为DNA双螺旋的骨架是由磷酸残基和脱氧核糖组成，而磷酸带负电荷，使得 DNA带负电），使TAE缓冲液浸没胶块4、 上样：首先在第1和第11 （14）泳道加入marker （即DL500）,然后根据实验三中三种 不同的检测项目（即 CaMV 35S启动子、抗草甘膦基因、lecti n 基因的扩增）可分为三组， 具体泳道标号为：2、3、4; 5、6、7; 8、9、10.即每组三个泳道，泳道顺序统一为：阳性 转基因大豆样品、进口转基因大豆样品、 非转基因大豆。另分别在11、12、13泳道上样CaMV 35S启动子、抗草甘膦基因、Lectin基因检测组的空白对照。所有样品

25、（20卩L）与5卩L6X buffer混匀，小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿5、跑电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。恒流，100mA电泳至指示剂跑到胶的1/2处即可停止（一般大概需 30min）6、紫外灯下看电泳结果五实验结果观察紫外光下是否有电泳DNA条带的出现六实验讨论分析结果及其说明了什么七注意事项1、倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡，待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶。2、 待胶完全凝固后拨出梳子，然后向槽内加入TAE稀释缓冲液至液面恰好

26、没过胶板上表面时，因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。3、注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。4、 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶的1/3，否则易溢出。实验五结果分析把经过CTAB法提取纯化得到三种大豆细胞总DNA根据检测项目的不同可均分成三组，每组顺序统一为：阳性转基因大豆样品、进口转基因大豆样品、非转基因大豆。分别进行 PCR扩增检测。泳道 1 和泳道 11 （14）为加入的 marker。 DL500 DNA Marker 为已含有 1 x Loading Buffer 的 DNA溶液，可取 5 卩 l 直接

27、电泳。DL500 DNA Marker 由 DNA片段 500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、 150 bp、100 bp、50 bp组成，共7条带。每次取 5 卩l电泳时，每条带的 DNA量约为50 ng，其中200 bp的DNA片段量约为150 ng，显示亮带。泳道2、3、4是三种大豆基于CaMV 35S启动子（35S启动子大小为：195bp）的检测，检测 为阳性时，则结果应该是在 marker200bp附近出现条带，由于泳道 2和3（4?）分别为转基因 阳性大豆和普通非转基因大豆，因此泳道2在200bp附近出现条带而泳道4在相应位置不出现条带。泳道3在200bp附近是否出现条带则直接证明进口转基因大豆样品是否含有CaMV35S启动子。鉴于绝大部分转基因植物都含有CaMV 35S启动子，若检测结果为阳性则说明检测的进口转基因大豆确为转基因，反之则为非转基因。本组主要进行大豆样品的初步定性是否为转基因。泳道5、6、7是三种大豆样品基于外源基因的检测，由于绝大部分转基因大豆都