仪器分析05分子发光分析法新

1、第五章第五章 分子发光分析分子发光分析 Molecular Luminescence Analysis分子发光分析（分子发光分析（1）分子分子吸收吸收一定一定能量能量后后外层电子外层电子将由基态跃迁至激发态，若将由基态跃迁至激发态，若从从激发态激发态返回返回基态基态时伴随时伴随光辐射光辐射现象，即称为分子发光，现象，即称为分子发光，基于该现象的分析方法为分子发光分析法基于该现象的分析方法为分子发光分析法（UV-Vis区）区）分子发光的类型分子发光的类型光致发光光致发光化学发光化学发光生物发光生物发光按激发模式按激发模式荧光荧光磷光磷光按激发态类型按激发态类型分子发光分析（分子发光分析（2）分子

2、发光与分子发光与UV-Vis应用范围相似，但具有以下特点：应用范围相似，但具有以下特点： 灵敏度高；灵敏度高；检出限较检出限较UV-Vis法低法低2 4个数量级个数量级原因：原因：黑背景检测；荧光强度与光源强度呈正比黑背景检测；荧光强度与光源强度呈正比v 选择性好；选择性好；w 线性范围宽；线性范围宽； 发光参数多发光参数多且对所研究体系局部环境因素敏感；且对所研究体系局部环境因素敏感；在光学分子传感器及生物医学、药学和环境科学方面具有优势在光学分子传感器及生物医学、药学和环境科学方面具有优势适用体系不如适用体系不如UV-Vis广泛。广泛。5-1-1 分子荧光分子荧光/磷光分析原理（磷光分析原

3、理（1）分子荧光分子荧光/磷光产生磷光产生激发态分子激发态分子基态分子基态分子单色器单色器检测器检测器光源光源激发态分子不稳定，当其返回基态时，多余的能量将以激发态分子不稳定，当其返回基态时，多余的能量将以何种途径释放？何种途径释放？0I tI 单重态与三重态单重态与三重态HOMOLUMO基态基态激发单重态激发单重态激发三重态激发三重态基态单重态至激发三重态为禁阻跃迁（难发生）基态单重态至激发三重态为禁阻跃迁（难发生）；11STEE 5-1-1 分子荧光和磷光分析原理（分子荧光和磷光分析原理（2）去活化：去活化：激发态分子激发态分子基态分子基态分子去活化方式去活化方式发射光子发射光子非辐射跃迁

4、非辐射跃迁化学反应化学反应荧光荧光磷光磷光振动驰豫振动驰豫内转换内转换外转换外转换系间跨越系间跨越速度快、激发态寿命短的途径先发生速度快、激发态寿命短的途径先发生荧光的产生荧光的产生2S0S1S2 1 3 吸吸收收激发单重态激发单重态内转换内转换振动驰豫振动驰豫vv荧荧光光内转换：内转换：10-11 10-13 s振动驰豫：振动驰豫：10-12 10-14 s荧光发射：荧光发射：10-9 10-7 s无无辐辐射射跃跃迁迁 0 , 0S v, eS吸收吸收/激发激发 0 , 1S内转换内转换振动驰豫振动驰豫 v, 0S荧光荧光振动驰豫振动驰豫内转换内转换外转换外转换荧光光谱为带状光谱；荧光光谱为

5、带状光谱；荧光光谱较吸收光谱红移；荧光光谱较吸收光谱红移；荧光光谱与吸收光谱对称。荧光光谱与吸收光谱对称。磷光的产生磷光的产生2S0S1S1 2 3 吸吸收收激发单重态激发单重态vv荧荧光光无无辐辐射射跃跃迁迁激发三重态激发三重态系间跨越系间跨越1T磷磷光光 v, 1S v, 1T系间跨越系间跨越 0 , 1T v, 0S磷光磷光振动驰豫振动驰豫内转换内转换外转换外转换振动驰豫振动驰豫磷光也是带状光谱磷光也是带状光谱磷光较荧光光谱红移磷光较荧光光谱红移磷光较荧光寿命长磷光较荧光寿命长 荧光发射：荧光发射：10-9 10-7 s 磷光发射：磷光发射：10-4 10 s荧光与磷光可能共存荧光与磷光

6、可能共存 0 , 0S内转换内转换振动驰豫振动驰豫振动驰豫振动驰豫4 实验教学安排与要求实验教学安排与要求学时：学时：44（共共11个实验，具体内容及安排见个实验，具体内容及安排见实验安排表实验安排表）要求：要求：实验前实验前自学或温习自学或温习相关理论知识，完成实验报告预相关理论知识，完成实验报告预习部分（注意规范性）；实验时必须携带预习报告准时出习部分（注意规范性）；实验时必须携带预习报告准时出席；实验过程中应遵守课堂纪律及教师要求席；实验过程中应遵守课堂纪律及教师要求成绩评定：成绩评定：每次实验均计入总分，请假无法补做时当次实每次实验均计入总分，请假无法补做时当次实验成绩为验成绩为0，无

7、故缺席一次则总成绩为，无故缺席一次则总成绩为0注意理论课与实验课之间的联系注意理论课与实验课之间的联系作业作业1第第3题题编号编号123移取试样溶液的体积移取试样溶液的体积/mL0.005.005.00加入加入5.00 mg L-1 Cu2+标准溶液的体积标准溶液的体积/mL0.000.002.50用用0.1 mol L-1的的HNO3定容至定容至25.00 mL所测的仪器信号所测的仪器信号S0.0100.1650.385用某仪器方法测定试样中微量用某仪器方法测定试样中微量Cu含量：称取试样含量：称取试样0.750 g，溶解，溶解后定容到后定容到100 mL容量瓶中作为试样溶液，测定时溶液的配

8、制及容量瓶中作为试样溶液，测定时溶液的配制及对应仪器信号对应仪器信号S如下表所示，计算试样中如下表所示，计算试样中Cu的质量分数（的质量分数（%）解解：010. 0165. 0010. 0385. 0 22CuCuc555 . 2c5-1CuLmg 76. 1c2 %100m/VcwsCuCu2 %023. 0%10075. 0/101 . 076. 13 作业作业1第第5题题采用原子吸收光谱法测定水样中的采用原子吸收光谱法测定水样中的Mg含量：含量：在在5个个50 mL的容量瓶中分的容量瓶中分别加入别加入10.00 mL水样、水样、1 mL 1:1 HCl和和2.5 mL 10% SrCl2

9、，再加入不同，再加入不同体积体积5.00 g mL-1 的的Mg标准溶液后定容。用空白溶液调零后依次测定标准溶液后定容。用空白溶液调零后依次测定各容量瓶中溶液的吸光度，相关数据见下表，（各容量瓶中溶液的吸光度，相关数据见下表，（1）求水样中）求水样中Mg的含量的含量（以（以 g mL-1表示）；（表示）；（2）空白溶液应如何配制？）空白溶液应如何配制？ 容量瓶编号容量瓶编号V水样水样/mLV标准溶液标准溶液/mL吸光度吸光度A110.0000.082210.001.000.160310.002.000.238410.003.000.318510.004.000.394解：解：（1）依题可知加入

10、）依题可知加入Mg标浓度及对应吸光度值如下表：标浓度及对应吸光度值如下表：cMg/ g mL-100.100.200.300.40A0.0820.1600.2380.3180.3945-1-1 分子荧光和磷光分析原理（分子荧光和磷光分析原理（3）任何荧光（磷光）化合物都具有任何荧光（磷光）化合物都具有激发激发和和发射发射两个特征光谱，这两个特征光谱，这是对其进行定或量定性的基础。是对其进行定或量定性的基础。 激发光谱：激发光谱：即激发效率随波长变化的曲线。激发的本质就是物即激发效率随波长变化的曲线。激发的本质就是物质吸收光的过程，因此激发光谱与吸收光谱相似。质吸收光的过程，因此激发光谱与吸收光

11、谱相似。 发射光谱：发射光谱：又称荧光（磷光）光谱，指激发波长固定时，发光又称荧光（磷光）光谱，指激发波长固定时，发光强度对波长变化的曲线。强度对波长变化的曲线。nmnm510nm380镁镁-Oxine的激发光谱和发射光谱的激发光谱和发射光谱ex em v, 0S0 , 1Sv, eS0 , 0S发射发射内转换、振动驰豫内转换、振动驰豫激发激发激发光谱与发射光谱的绘制激发光谱与发射光谱的绘制激发光谱：激发光谱：改变激发波长，测量最强荧改变激发波长，测量最强荧/磷光发射波长磷光发射波长 em处的处的强度变化，以激发波长对荧强度变化，以激发波长对荧/磷光强度作图可得到激发光谱。磷光强度作图可得到激

12、发光谱。发射光谱：发射光谱：固定激发波长在最大激发波长固定激发波长在最大激发波长 ex处，测定不同发射处，测定不同发射波长处的荧波长处的荧/磷磷/光强度，以发射波长对荧光强度，以发射波长对荧/磷光强度即可得的荧磷光强度即可得的荧/磷光的发射光谱。磷光的发射光谱。 v, 0S0 , 1Sv, eS0 , 0S发发射射内内转转换换、振振动动驰驰豫豫激激发发激发光谱激发光谱 固定固定em 扫描扫描n1 发射光谱发射光谱 固定固定ex 扫描扫描21 如何确定如何确定 ex和和 em？ 来源于资料或文献（需进行验证）来源于资料或文献（需进行验证）v 先先以该分子的以该分子的 max作为作为 ex扫描发射

13、光谱，可得扫描发射光谱，可得 em；再固；再固定定 em扫描激发光谱，可得扫描激发光谱，可得 ex；若；若 ex= max，终止扫描，若，终止扫描，若 ex = max，应反复扫描直至应反复扫描直至 ex、 em不再发生变化。不再发生变化。发射光谱形状通常与激发波长无关，因此只需少数几次扫发射光谱形状通常与激发波长无关，因此只需少数几次扫描，描， ex、 em即可固定。即可固定。w 若仪器可测定三维荧光图，可通过等高线图确定若仪器可测定三维荧光图，可通过等高线图确定蒽的三维荧光谱图（蒽的三维荧光谱图（1）固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长蒽的三维荧光谱图（蒽的三维荧光谱图（2

14、）固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱5-1-1 分子荧光和磷光分析原理（分子荧光和磷光分析原理（4）荧光光谱的特点荧光光谱的特点Stokes位移位移荧光发射光谱形状与激发波长无关荧光发射光谱形状与激发波长无关镜像规则镜像规则Stokes位移位移吸收光谱吸收光谱荧光光谱荧光光谱蒽的乙醇溶液蒽的乙醇溶液吸收光谱吸收光谱荧光光谱荧光光谱emmax )v, 1(S)0 , 0(S)v, 0(S)0 , 1(S荧光发射光谱形状与激发波长无关荧光发射光谱形状与激发波长无关蒽蒽-乙醇溶液乙醇溶液荧光光谱荧光光谱激发光谱激发光谱)v, 0(S)0

15、, 1(S)v, 0(S)0 , 0(S镜像规则镜像规则电子能级处于基态和激发态的分子振动电子能级处于基态和激发态的分子振动能级间隔相等。能级间隔相等。5-1-1 分子荧光和磷光分析原理（分子荧光和磷光分析原理（5）荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系分子产生荧光必须具备的条件：分子产生荧光必须具备的条件：具有与照射频率相适应具有与照射频率相适应的结构；的结构；vv具有一定的荧光量子产率（具有一定的荧光量子产率（ f: 0.1 1） ifffKKK吸收的光量子数吸收的光量子数发射的光量子数发射的光量子数Kf:荧光辐射速率荧光辐射速率Ki:其它过程速率其它过程速率 f的大小主要决定与分子的结

16、构和性质，但与分子所处的环境的大小主要决定与分子的结构和性质，但与分子所处的环境因素对其也有很大的影响。因素对其也有很大的影响。荧光量子产率荧光量子产率 f的测定的测定测定测定待测荧光物质待测荧光物质与与 f已知的已知的参比荧光物质参比荧光物质两者两者稀溶液稀溶液在在相同激发条件下所测得的积分荧光强度（即发射光谱所包相同激发条件下所测得的积分荧光强度（即发射光谱所包含的面积）和对应激发波长的吸光度，然后按以下公式计含的面积）和对应激发波长的吸光度，然后按以下公式计算可得：算可得：xfssfxsxAIAI If：积分荧光强度积分荧光强度A：吸光度吸光度s：参比荧光物质参比荧光物质x：待测荧光物质

17、待测荧光物质nm/ fI标准标准待测待测荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系跃迁类型（跃迁类型（* n*）共轭效应共轭效应刚性平面结构刚性平面结构取代基效应取代基效应共轭效应共轭效应分子中必须具有大的共轭分子中必须具有大的共轭 键结构。共轭度越大，发射波键结构。共轭度越大，发射波长红移，发光强度增加。长红移，发光强度增加。一般具有高度共轭稳定性的芳香一般具有高度共轭稳定性的芳香族化合物有荧光族化合物有荧光；单个杂环芳烃无荧光，而其与苯环共轭；单个杂环芳烃无荧光，而其与苯环共轭就有荧光；脂肪族和脂环族化合物通常无荧光。就有荧光；脂肪族和脂环族化合物通常无荧光。CO-OOCOO-荧光黄荧光黄苯

18、并芘苯并芘刚性平面结构刚性平面结构COCOO-OCOCO O-OONO-NOMgNOCH2酚酞（无荧光）酚酞（无荧光）8-羟基喹啉（弱荧光）羟基喹啉（弱荧光）联二苯联二苯 0.2荧光黄荧光黄红色荧光红色荧光芴芴 1.0刚性平面结构可减小分子振动，使分子与溶剂和其他溶剂分子碰撞失活可能性降低刚性平面结构可减小分子振动，使分子与溶剂和其他溶剂分子碰撞失活可能性降低取代基的影响取代基的影响给电子基给电子基增强荧光：增强荧光： OH、OR、-NH2、NHR、NR2、CN等等吸电子基吸电子基减弱荧光：减弱荧光： COOH、C=O、NO2、NN等等重原子效应重原子效应（例：苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧

19、光（例：苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，但磷光会增强）逐渐减弱到消失，但磷光会增强）分子内氢键作用分子内氢键作用会增加分子平面性和刚性会增加分子平面性和刚性OHCOOHOHCOOHOHOHCO水杨酸水杨酸无机荧光材料无机荧光材料目前，常见的无机荧光材料是以碱土金属的硫化物（如目前，常见的无机荧光材料是以碱土金属的硫化物（如 ZnS、CaS）、铝酸盐（）、铝酸盐（SrAl2O4、CaAl2O4、BaAl2O4）等）等作为发光基质，以稀土镧系元素（铕作为发光基质，以稀土镧系元素（铕Eu、钐、钐Sm、铒、铒Er、钕钕Nd等）作为激活剂和助激活剂。等）作为激活剂和助激活剂。 5-1-

20、1 分子荧光和磷光分析原理（分子荧光和磷光分析原理（6）溶液的荧光（磷光）强度溶液的荧光（磷光）强度荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素溶液荧光的淬灭溶液荧光的淬灭荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度荧光强度IF正比正比于吸收的光强于吸收的光强Ia和荧光量子产率和荧光量子产率 f根据根据L-B定律，可求出吸收光强定律，可求出吸收光强Ia的表达式的表达式faFII lc3 . 20lc0t0ae1I101IIII lc3 . 2f0fe1II FcfIkclcI3 . 2If0f lc 0.05光源的强度与稳定对荧光信号的强度和

21、稳定影响极大光源的强度与稳定对荧光信号的强度和稳定影响极大影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素 溶剂效应（一般和溶剂效应（一般和特殊：发生相互作用特殊：发生相互作用） 温度和黏度（温度和黏度（T F ；黏度；黏度 ，F ） pH 有序介质的影响（表面活性剂或环糊精有有序介质的影响（表面活性剂或环糊精有增敏效果增敏效果） 内滤光与自吸内滤光与自吸 散射光的影响散射光的影响CD pH值对荧光光谱的影响值对荧光光谱的影响具酸或碱性基团的有机物质，在不同具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因生变化，因而荧光强度将发生改

22、变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，也可使其荧光强度发生改变。值会影响其稳定性，也可使其荧光强度发生改变。OHpH 1，有荧光有荧光O -pH 13，无荧光无荧光O H无荧光无荧光O-有荧光有荧光内滤光和自吸内滤光和自吸体系内存在可以吸收激发光或荧光的物质造成荧光强度降低的体系内存在可以吸收激发光或荧光的物质造成荧光强度降低的现象称为现象称为“内滤光现象内滤光现象”；若荧光物质的荧光短波长与激发光；若荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，在其浓度较大情况下可吸收自身的荧光而造成长波长有重叠，在其浓度较大情况下可吸收自身的荧光而造成荧光强度降低的现象称为荧光强度降低的现象称为“自吸收

23、自吸收”。K2Cr2O7的吸收峰与的吸收峰与A，F有重叠有重叠200250300350400450500550600650700750800850900080016002400320040004800 IF 共振光散射共振光散射瑞利散射瑞利散射拉曼光拉曼光二级共振光散射二级共振光散射三级共振光散射三级共振光散射散射光的影响散射光的影响 荧光分析中常出现荧光分析中常出现Retleigh散射光、容器表面的散射光、散射光、容器表面的散射光、Tyndall及及拉曼散射拉曼散射等，波长选择适当，可以消除其影响等，波长选择适当，可以消除其影响固定固定 ex=270nm硫酸喹啉及其溶剂（硫酸溶液）在不同激发

24、波长下的光谱硫酸喹啉及其溶剂（硫酸溶液）在不同激发波长下的光谱瑞利散射与激发光波长相等瑞利散射与激发光波长相等拉曼散射与激发光波长有关拉曼散射与激发光波长有关荧光与激发波长无关且红移荧光与激发波长无关且红移溶液荧光的淬灭溶液荧光的淬灭能引起荧光物质荧光强度降低的物质称为能引起荧光物质荧光强度降低的物质称为淬灭剂淬灭剂，常见，常见淬灭类型有一下几种：淬灭类型有一下几种： 碰撞猝灭碰撞猝灭（碰撞后无辐射失活）（碰撞后无辐射失活） 静态猝灭静态猝灭（形成非荧光配合物）（形成非荧光配合物） 转入三重态猝灭转入三重态猝灭（发生系间跨越，若重原子、溶解氧等）（发生系间跨越，若重原子、溶解氧等） 电子转移猝

25、灭电子转移猝灭 基于荧光淬灭现象可实现淬灭剂的分析基于荧光淬灭现象可实现淬灭剂的分析y 自猝灭自猝灭250350450nmF1234nm422ex 丁二酮丁二酮in CCl41 0.015 mol/L2 0.045 mol/L3 0.150 mol/L4 0.450 mol/L5-1-2 荧光荧光/磷光光谱仪（磷光光谱仪（1）光源光源激发光单色器激发光单色器样品池样品池检测器检测器数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射光单色器发射光单色器与与UV-Vis仪器相比：仪器相比：有两个独立的单色器，分别位于光源有两个独立的单色器，分别位于光源与样品池之间（激发光单色器）和样品与样品池之间（激发光单色器

26、）和样品池与检测器之间（发射光单色器）池与检测器之间（发射光单色器）v光源与检测器不在同一光路上，以避光源与检测器不在同一光路上，以避免透射光的影响（吸收池四面透光）免透射光的影响（吸收池四面透光）5-1-2 荧光荧光/磷光光谱仪（磷光光谱仪（2） 光源：光源：通常采用通常采用氙灯氙灯。激发器激发器最为理想，高压汞灯也被采用。最为理想，高压汞灯也被采用。 单色器：单色器：位于样品池前后位于样品池前后独立两个独立两个，用于选择激发，用于选择激发/发射波长发射波长 样品池：样品池：熔融石英熔融石英制成，四面透光（固体可直接测定）制成，四面透光（固体可直接测定） 检测器：检测器：通常采用通常采用光电

27、倍增管光电倍增管（PMT），其他光电检测器也），其他光电检测器也被采用。被采用。Perkin-Elmer LS50 Fluorimeter5-1-3 荧光荧光/磷光分析法应用（磷光分析法应用（1）定量分析方法定量分析方法（标准曲线法）（标准曲线法） 确定测定波长确定测定波长 ex/ em 设定设定 ex/ em及适当狭缝宽度及适当狭缝宽度w 测定标准系列的测定标准系列的If，绘制，绘制If-c曲线曲线 测定未知样品的测定未知样品的If，根据标准曲线求其浓度根据标准曲线求其浓度 需配制适当的空白溶液校正空白信号需配制适当的空白溶液校正空白信号 检出限低于检出限低于UV-Vis，但重现性不如，但重

28、现性不如UV-Vis狭缝宽度的设定狭缝宽度的设定激发光单色器激发光单色器发射光单色器发射光单色器检测器检测器放大器放大器记录仪记录仪狭缝狭缝样品池样品池激发光出射狭缝激发光出射狭缝（带宽）和（带宽）和发射光出射狭缝发射光出射狭缝（带宽）直接决定所测荧（带宽）直接决定所测荧光的强度，因此实验中需要合理设置，通常有光的强度，因此实验中需要合理设置，通常有2、5、10、20 nm几档选几档选择，选择原则如下：择，选择原则如下：带宽不应超过对应光谱的宽度；带宽不应超过对应光谱的宽度；v ex和和 em相差不大时，应适当减小带宽，以避免干扰；相差不大时，应适当减小带宽，以避免干扰；w存在干扰物质时可适当

29、减小带宽存在干扰物质时可适当减小带宽若待测物质见光易分解，应若待测物质见光易分解，应适当减小激发光的出射带宽，适当减小激发光的出射带宽，如维生素如维生素C、维生素、维生素B12等等5-1-3 荧光荧光/磷光分析法应用（磷光分析法应用（2）常规测定方法常规测定方法直接测定直接测定间接测定间接测定 荧光衍生法荧光衍生法 荧光淬灭法荧光淬灭法 敏化荧光法敏化荧光法多组分混合物的荧光分析多组分混合物的荧光分析直接法测定直接法测定食品中苯并芘的测定（食品中苯并芘的测定（GB/T 5009.27-2003）环己烷（石油醚）环己烷（石油醚）提取提取，浓缩浓缩层析柱层析柱净化净化纸色谱纸色谱分离分离（用标注物

30、定性）（用标注物定性）剪下斑点用苯剪下斑点用苯溶解溶解ex=365 nm，扫，扫描描365 460 nm范围内的荧光光谱与标准物对比（范围内的荧光光谱与标准物对比（定性定性）ex/ em=365/406 nm处处定量。定量。其他例子见课本其他例子见课本p98表表5.4荧光衍生法荧光衍生法根据衍生手段可分为化学衍生法、电化学衍生法和光化学根据衍生手段可分为化学衍生法、电化学衍生法和光化学衍生法。化学衍生法最为常用，所涉及的反应有配位、降衍生法。化学衍生法最为常用，所涉及的反应有配位、降解、氧化还原、偶联、缩合、酶催化等等。解、氧化还原、偶联、缩合、酶催化等等。 荧光法测定血清中的镁荧光法测定血清

31、中的镁 荧光法测定水样中的过氧化氢荧光法测定水样中的过氧化氢2Peroxidase22OHCOOHOHOCH3COOHOHOCH3OHH3COHOOCnm450nm335emex NOMgNO其他例子见课本其他例子见课本p98表表5.5多组分混合物的荧光分析多组分混合物的荧光分析蒽的激发和发射光谱蒽的激发和发射光谱菲和蒽的荧光光谱菲和蒽的荧光光谱（激发波长（激发波长 265 nm) 利用共存组分的激发利用共存组分的激发/发射光谱的差异实现分别测定发射光谱的差异实现分别测定蒽和菲的测定蒽和菲的测定菲在菲在360 nm以上无吸收，用以上无吸收，用365 nm激发光时，菲无荧光，可以在激发光时，菲无

32、荧光，可以在400 nm测定蒽的荧光。测定蒽的荧光。在在265 nm, 蒽和菲均有吸收，以此波蒽和菲均有吸收，以此波长的光激发，在长的光激发，在350 nm只有菲有荧光，只有菲有荧光，故可测定菲。故可测定菲。5-1-3 荧光荧光/磷光分析法应用（磷光分析法应用（3）荧光法的其他应用荧光法的其他应用 测定蛋白质及研究蛋白质的结构（荧光探针、偏振荧光）测定蛋白质及研究蛋白质的结构（荧光探针、偏振荧光）v 免疫分析（或酶联免疫分析）或核酸分析中的免疫分析（或酶联免疫分析）或核酸分析中的标记物标记物 平板色谱中斑点定位、液相色谱的检测器平板色谱中斑点定位、液相色谱的检测器其他荧光分析技术其他荧光分析技

33、术 激光诱导荧光激光诱导荧光/时间分辨荧光时间分辨荧光/荧光偏振荧光偏振/同步荧光同步荧光荧光显微镜荧光显微镜人肝癌细胞人肝癌细胞5-1-4 分子磷光的测定（分子磷光的测定（1）低温磷光低温磷光由于由于T1寿命较长，为减小非辐射失活的影响，通常需在低温（液氮）寿命较长，为减小非辐射失活的影响，通常需在低温（液氮）条件下测定磷光。对所用溶剂的基本要求是：条件下测定磷光。对所用溶剂的基本要求是：易提纯且在分析波长易提纯且在分析波长区无强吸收和发射；区无强吸收和发射；vv低温下形成具足够粘度的透明的刚性玻璃体。低温下形成具足够粘度的透明的刚性玻璃体。 常用的溶剂：常用的溶剂：EPA乙醇乙醇+异戊烷异

34、戊烷+二乙醚（二乙醚（2+2+5）IEPACH3I+EPA（1+10）5-1-4 分子磷光的测定（分子磷光的测定（2）室温磷光（室温磷光（RTP） 固体基质：固体基质：以固体基质（如纤维素等）吸附磷光物质，增加其分子刚以固体基质（如纤维素等）吸附磷光物质，增加其分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 胶束增稳：胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，减小内转换和碰撞等去活化的几率，光体的微环境、增加定向约束力，减小内转换

35、和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。利用提高三重态的稳定性。利用胶束增稳、重原子效应和溶液除氧胶束增稳、重原子效应和溶液除氧是该法是该法的三要素。的三要素。 敏化磷光：敏化磷光：其过程可以简单表示为：（选择合适受体是该法关键）其过程可以简单表示为：（选择合适受体是该法关键）01T1T1ShvSBAAA发射磷光发射磷光能量转移能量转移系间跨越系间跨越受体受体分析物分析物5-1-4 分子磷光的测定（分子磷光的测定（3）磷光光谱仪磷光光谱仪与在荧光光谱仪的基础上，增加磷光配件与在荧光光谱仪的基础上，增加磷光配件 磷光镜磷光镜 杜瓦瓶杜瓦瓶（用于低温磷光测定）（用于低温磷光测定）利用荧光利用荧光/磷光寿命不同来去除荧光信号磷光寿命不同来去除荧光信号5-2 化学发光分析（化学发光分析（1）若某一化学反应产生电子激发态产物，当其返回基态时发出的若某一化学反应产生电子激发态产物，当其返回基态时发出的光称为光称为化学发光化学发光。（。（生物发光生物发光特指发生在生命