pIRES2-EGFP-hIL-10真核表达载体构建及鉴定

1、plres2-egfp-hll-10真核表达载体构建及鉴定摘要目的 构建带有报告基因egfp的hil/o真核表达载体。方法通过rt-pcr方法从人外周血淋巴细胞中扩增出il-10基因，构建il-10基因和报告基因egfp基因真核表达载体plres2-egfp-hll-10,经pcr、酶切、测序等方法 进行鉴定，紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度。结果酶切、pcr及测序证实plres2-egfp-hll-10载体序列正确。结 论 成功构建真核表达载体plres2-egfp-hll-10,可为后续器官移植免疫耐受的研究奠定基础。关键词基因;il/o基因;真核表达载体;载体构建中图分类号q754文献标

2、识码a文章编号1673-9701 (2009)34-01 -03con structionandide ntificationofplres2-egfp-hll-10 plasmidchen lihongiliu jingfeng2fang hangrongiqiuminglian21. department of pathology,fujia n medicaluniversity,fuzhou 350004,china;2.the first affiliatedhospital offujia nmedical university,fuzhou350004,chi naabstrac

3、t objective to construct the plres2-egfp-hll-10 plasmid of human. methods il-10 gene was amplified from human peripheral blood lymphocytes by using rt-pcr,a ndthe nplres2-egfp-hll-10 plasmid was constructed the identificati on was done by using en donuclease cutting,pcr and seque ncing and the plasm

4、id concentration and purity were detected by using uv spectrophotometer. results endonuclease cutting. pcr andsequencing showed the successful construction of plres2-egfp-hll-10 plasmid.conclusion we construct plres2-egfp-hll-10 plasmid successfully and lay the foundati on for immuno tolerance resea

5、rches! n the orga n tran spla ntatio n.key words gene;ilgene;eukaryotic expression vector;vector con structi on白细胞介素 10(interleukin 10,il-10)是最初由 mosman 等1989年发现的一种由th2分泌的细胞因子，它能抑制thl 细胞因子的分泌。近来,越来越多的研究表明il-10具有抑制 免疫活性细胞的激活和细胞因子产生的作用,与移植物排斥有密切关系，因此在器官移植领域，越来越多的研究表 明jl-10能通过多种途径来抑制或减轻排斥反应，从而延长 移植物的存活

6、时间。我们通过构建hll-10真核表达载体为今 后在器官移植免疫耐受的进一步实验研究提供依据。1材料与方法 1.1外周血单核细胞的制备取正常人新鲜抗凝血5ml与hanks液等量混匀后，加于4ml淋巴细胞分离液上,离心收集细胞，用5ml含10%的胎牛血清1640cm培养液悬浮，加入25mg/l的cona,于37°c.5% co2培养箱中孵育24h。1.2rt-pcr 扩增人 il-10m因淋巴细胞经cona刺激后，用trizol试剂按说明书提取总rnao逆转录体系为：模板rna溶液5|jl,5xrt buffer 4pl,dntp(各 10mmol/l)混合物 2pl,rna 酶抑制剂

7、 05pl,引物设计参照genbank上人il-10基因序列分别设计引物下、下游引物。上游引物:il-10f:ccgctcgag ccacc atgcacagc tcagcactgctct, 下 游 弓 i 物:il-10r:ccggaattctcagtttcgtatcttcattgtco oligo(dt)引物 1pl,amv 返转录depc 水 6.5plo 42°c保温仆,置 95°c温育 5min 使amv逆转录酶失活。将此反转录产物直接进行pcro目的片段大小约540bpo pcr反应条件:949预变性2min,94°c变性30s,65°c退火

8、30s,72°c延伸1min,共30个循环，最后729延伸10mino pcr产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定 (100v,30min),)胶成像系统摄像。1.3真核表达载体plres2七gfp41il10的构建 1 %琼脂糖凝胶电泳分离并回收pcr产物，连同plres2-egfp空载体，经xho i和ecor i双酶切后,t4 dna连接细胞。挑取单克隆菌落进行扩增培养，采用hispeed plasmidmidi kit质粒纯化试剂盒(qiagen公司)抽提质粒，详见说明书。1.4真核表达载体plres2-egfp-hll10鉴定1.4.1限制性内切酶酶切、电泳及片段回收取il-10质

9、粒 抽提产物用(ctcgag ccacc atg)和(gaattc tca)双 酶切，反应体系:xho i 1pl,ecor i 1pl,10xk buffer 2pl,重组 质粒(118pg/ml)5|jl,灭菌双蒸水11|jl,反应混合液混匀后置 379酶切过夜后,1 %琼脂糖电泳(100v,30min)凝胶成像仪成 像。1.4.2pcr法鉴定hll-10 的基因片段il/0基因上游引物:5 atgc acag ctca gcac tgct ct 3,下游：5 tcagttc gtat cttc attg tc 3,预期产物大小为 450bp。反应总体积25pl仮应体系如下:10xbuff

10、er 2.5pl,3k菌双蒸水 17.375pl, dntp mixture（各 2.5mm）2pl,±游引物(10mm)1ml,下游引物(10pm)1pl,液1pl,taq(5u/pl)0.125pl,总体积 25pl。pcr 反应条件:949预变性5min,94°c变性30s,55°c退火30s,72°c延伸30s,共30个循环，最后729延伸7mino pcr产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定（100v,30min）,；m胶成像系统摄像。1.4.3测序取质粒抽提产物1ml,用通用引物送博亚公司测序。2结果 2.1hll-10m因的pcr产物电泳分析琼脂糖

11、凝胶电泳结果显示,pcr扩增产物均为一条带，对比marker,大小同预期结果一致（图1）o2.2重组质粒的酶切鉴定紫外灯下定位切取所需dna片段凝胶条，重组质粒plres2 -egfp-hll-10酶切后显示2kb和540bp两个条带（图 2）。2.3重组质粒测序鉴定重组质粒plres2-egfp-hll-10抽提产物测序结果（图3）,经genebank的序列比对,两重组目的基因序列完全正确。2.4重组质粒的结构图（图4）2.5紫外分光光度计测定中量抽提质粒确定浓度及纯度(ai)3讨论白细胞介素10(lnterleukin10,il-10)最初于1989年由fiorentino等发现，他们证明

12、il-10由th2淋巴细胞和单核细胞合成分泌,具有抗炎和抑制多种细胞因子合成的作用，所以 称之为细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibiting factor,csif)1o人il-10(hll-10)基因定位于第一号染色体上，编码178个氨基酸,其中含18个氨基酸疏水信号序列，成 熟蛋白含160个氨基酸。il/0的生物学功能主要有il-10 能抑制抗原特异的t细胞增殖和分泌致炎细胞因子。il/0 能直接作用于t细胞上的cd28协同刺激受体，阻断cd28 酪氨酸磷酸化过程和cd28分子介导的信号传导通路，从而 有效抑制t细胞的增殖和细胞因子的产生，诱导t细胞耐受

13、。 此外,il-10还可以通过特异的抑制t细胞il-2的分泌而抑制 t细胞的增殖2。il-10这种抑制t细胞分泌 il-2,tnf-a,ifn-y的作用可使机体的迟发性变态反应受到抑 制。此外,il-10通过抑制ifn-y的产生抑制nk细胞的活性。 它对单核细胞和巨噬细胞的影响也主要是抑制性的。总 之jl-10的这些生物学活性显示其为一种潜在的免疫增殖反 应和炎症反应的负性调节因子36,是一种针对同种异体器 官移植的有益的细胞因子。目前的转基因载体主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。其中病毒载体较有效，是目前基因治疗的主要手段，但 病毒载体存在一些缺陷,包括安全性、免疫原性、对靶细胞有 一定

14、的毒性、非导向性。有限的携带能力，生产和包装问题、 成本高昂等，限制了其推广应用。非病毒类价格比病毒低廉且 安全，较少产生抗原性7。荧光蛋白标记技术是近年来迅速发展的一种新型细胞示踪技术，绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,gfp)基因 片段较小，易于构建融合蛋白，本实验中选用的pires2-egfp表达载体，进入靶细胞后,具有安全性好，容量 大等特点。以增强型绿色荧光蛋白(egfp)作为报告基因，使 egfp的荧光强度提高了 35倍，而且转染16 24h后仍可稳 定表达，由于egfp报告基因检测非常方便，有别其他报告基 因检测需加入底物，具有直观、及时、应用范围

15、广的特点，是 其他报告基因所无法比拟的。我们首先从人外周血分离得到 淋巴细胞，通过分子克隆的手段得到了人il-10基因,并成功 的构建出带有报告基因egfp的plres2- -hll-10真核表达 载体，目的基因进行了序列测定和相似性比对，结果显示与 genebank基因序列完全一致。同时,酶切、pcr鉴定结果显示构建成功。这将为下一步研究il/0在诱导器官移植免 疫耐受中的作用奠定前期基础。参考文献1 fiorentino df,bond mw,mosmann tr. two types of mouse t helper cell. iv. th2 clones secrete a fac

16、tor that inhibits cytokine production by th1 cionesj. j exp med,1989,170(6):2081-2095.2 傅继东.白介素-10、树突状细胞及免疫耐受j.国外 医学:免疫学分册,2001,24 03):133-136.3 steinbrink k, graulich e, kubsch s,et al. cd4(+) and cd8(+) an ergic t cells induced by in terleuki 0-treated huma n den dritic cells display antigen-speci

17、fic suppressor activity mj. blood, 2002, 99 :2468-24764 li wm,liu w,gao c,et al. antigen-specific tolerance induced by il10 gene modified immature dendritic cells in experimental autoimmune myocarditis in ratsj. chin med j,2006,119(19):1646- 1652.5 silva sr,jacysyn jf,macedo ms,et al. immunosuppressive components of ascaris suum down-regulate expression of costimulatory molecules and function of antigen-presenting cells via an il10mediated mechanismj. eur j immunol,2006,36(12):3227-32376 zhou x,yang n,lu l,et al. up-regulation of il-10 expression in dendriti